Teknologi Produksi Insulin

Analisis

Insulin adalah salah satu hormon yang diproduksi oleh tubuh manusia itu sendiri, khususnya pankreas. Pelanggaran terhadap sekresi zat ini menyebabkan munculnya penyakit serius seperti diabetes. Untuk perawatannya menggunakan hormon sintetis, yang lama terisolasi dari pankreas ternak. Namun, teknologi untuk memproduksi insulin dengan bantuan bakteri yang sangat umum - Escherichia coli atau jamur ragi telah digunakan untuk waktu yang cukup lama. Menggunakan metode ini memungkinkan Anda untuk menghindari reaksi alergi yang disebabkan oleh protein asing, yang memiliki sedikit perbedaan dari manusia.

Skema teknologi

Teknologi produksi insulin mencakup semua tahap utama produksi produk biotek. Hasilnya adalah produk akhir kristal, yang kemudian digunakan untuk menyiapkan solusi injeksi yang digunakan dalam pengobatan diabetes mellitus tipe I dan II yang parah. Efek utama hormon ini dalam tubuh dimanifestasikan dalam penurunan kadar glukosa yang terkandung dalam darah.

Tahapan produksi insulin adalah sebagai berikut:

Pendahuluan. Ini melakukan operasi seperti persiapan dan pemurnian air dan udara, pembersihan tempat industri dan sterilisasi peralatan, inspeksi personel, pemrosesan tangan dan penerbitan sepatu dan pakaian steril. Juga pada tahap awal, sintesis kimia utama dari rantai molekul dari mana protein dirakit dibuat. Rantai A mengandung 21 residu asam amino, dan rantai B mengandung 30 asam amino.
Persiapan solusi nutrisi dan kultur sel. Untuk membuat sel hidup menghasilkan senyawa yang diperlukan, gen yang sesuai diperkenalkan. Untuk ini, plasmid dipotong oleh enzim khusus, pembatasan, dan gen yang mengkode sintesis senyawa yang diperlukan dijahit ke dalamnya. Kemudian, dengan menggunakan metode injeksi mikro, plasmid yang dimodifikasi dikembalikan ke sel.
Penanaman suspensi sel. Sel-sel yang dimodifikasi secara genetik ditempatkan dalam larutan nutrisi, memiliki semua bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan reproduksi dan menjalani sterilisasi. Budidaya budaya berlangsung di bioreaktor khusus, di mana udara pra-dimurnikan diberi makan. Secara berkala sejumlah larutan nutrisi ditambahkan ke reaktor dan pada saat yang sama volume suspensi sel yang sama ditarik.
Alokasi budaya. Pemisahan cairan dan kultur sel dilakukan oleh sedimentasi (sedimentasi) dalam sedimentator khusus, dan kemudian filtrasi, yang memungkinkan untuk menjaga integritas sel.
Pemurnian kromatografi zat. Hal ini dilakukan pada peralatan yang sesuai, menggunakan berbagai metode, khususnya kromatografi permeasi frontal, pertukaran anion, dan gel.
Mendapatkan molekul protein. Pada tahap biotek aktual, terjadi sintesis molekul insulin yang tidak diproduksi. Dan dua komponen rantai itu. Mereka dijahit setelah oksidasi dan lipat dari rantai yang diperoleh, menghasilkan pembentukan jembatan disulfida.
Pengeringan beku dalam oven khusus, setelah itu persiapan kristalin yang dihasilkan diperiksa untuk kesesuaian dengan standar, dikemas, diberi label dan dikirim ke konsumen.

Perusahaan kami dengan persyaratan yang menguntungkan menawarkan jalur produksi siap pakai, di mana semua teknologi produksi insulin sepenuhnya dipenuhi. Berkat perhitungan yang akurat, dukungan teknis dan informasi, serta pelatihan personil dalam rangka program komprehensif, perusahaan akan menguntungkan dan produk-produknya akan diminati.

Penemuan insulin

Saat ini, diabetes menyerang lebih dari 400 juta orang di planet ini, yaitu sekitar 8% dari populasi orang dewasa di dunia. Menurut catatan negara, lebih dari 3,3 juta orang menderita diabetes di Rusia (sekitar 300 ribu orang menderita diabetes tipe 1, dan sekitar 3 juta orang menderita diabetes tipe 2). Namun, angka-angka ini tidak mungkin mencerminkan situasi sebenarnya. Semua orang ini, hidup setiap hari, memahami bahwa hidup mereka bergantung pada insulin.

Upaya pertama untuk menyembuhkan diabetes dilakukan sebelum era kita. Dokter Yunani dan Romawi Kuno digunakan untuk pijat ini, senam, mandi, aromaterapi dan banyak lagi. Pada abad ke-19, diet daging rendah karbohidrat dikembangkan untuk penderita diabetes. Upaya pertama untuk mengobati diabetes dengan suntikan insulin dilakukan pada tahun 1921. Ilmuwan Kanada Frederick Banting menjadi orang pertama yang menggunakan hormon insulin untuk mengendalikan diabetes. Dia hanya 32 kode ketika dia menerima Hadiah Nobel dalam bidang kedokteran. Dia menciptakan obat secara efektif dan tanpa efek samping mengurangi kadar glukosa dari 28,9 menjadi 6,7 mmol / l. Obat ini memberi harapan bagi banyak orang.

Pada tahun 1869, ilmuwan Paul Langergans menemukan kelompok sel di pankreas, yang kemudian dinamai menurut namanya "pulau Langerhans". Insulin kemudian diisolasi dari sel-sel pulau ini. Insulin adalah hormon yang mengatur metabolisme, terutama karbohidrat (gula), tetapi juga lemak dan protein. Pada diabetes karena paparan insulin yang tidak mencukupi, terjadi gangguan metabolisme yang kompleks, kadar gula darah meningkat (hiperglikemia), gula diekskresikan dalam urin (glikosuria), dan produk asam dari pembakaran lemak yang terganggu muncul dalam tubuh keton darah (ketoasidosis).

Setelah penemuan insulin, banyak ilmuwan mulai mengembangkan metode pembersihan obat ini, karena itu adalah pengotor yang memiliki efek merusak pada tubuh yang lemah.

Agilent Technologies adalah pemimpin global dalam peralatan analitik. Perangkat untuk analisis kromatografi dan spektral selama lebih dari satu tahun telah membantu para ilmuwan di seluruh dunia memecahkan masalah vital obat-obatan. Kontrol kemurnian insulin tidak terkecuali. Sebelumnya, kromatografi cair klasik digunakan untuk tujuan ini, sambil memperoleh hasil yang cukup dapat diterima:

Setelah banyak penelitian, para ilmuwan membuktikan bahwa insulin polipeptida yang terbentuk dengan berat molekul sekitar 6000, secara efektif diidentifikasi menggunakan perkembangan terbaru di bidang kromatografi eksklusi.

Dengan metode baru ini, seseorang dapat membandingkan "insulin baik", yang disimpan dalam kondisi yang direkomendasikan dan "insulin buruk". Ketika dua kromatogram ditumpangkan satu sama lain, ternyata dalam persiapan insulin, yang disimpan dalam kondisi yang merugikan, molekul target dihancurkan dan alih-alih itu, produk penguraian diidentifikasi pada kromatogram.

Pengembangan dan penyatuan metode untuk analisis dan standarisasi persiapan insulin menggunakan kromatografi cair tekanan tinggi (RP HPLC) fase terbalik, Pihtar Anatoly Vasilyevich

Tesis disertasi ini harus pergi ke perpustakaan dalam waktu dekat.
Beri tahu tentang penerimaan

Tesis - 480 rubel., Pengiriman 10 menit, sekitar jam, tujuh hari seminggu dan hari libur.

Abstrak - 240 rubel, pengiriman 1-3 jam, dari 10-19 (waktu Moskow), kecuali hari Minggu

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Pengembangan dan penyatuan metode untuk analisis dan standarisasi persiapan insulin menggunakan kromatografi cair tekanan tinggi fase terbalik (RP HPLC): disertasi. Calon Ilmu Farmasi: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Tempat perlindungan: Moscow Medical Academy "].- Moskow, 2005.- 139 hal.: Il.

Konten untuk disertasi

BAB 1. Tinjauan literatur 11

1. Peran insulin dalam pengobatan diabetes mellitus 11

2. Biosintesis dan aksi biologis insulin 12

3. Karakteristik umum sifat fisikokimia dan farmasi dari insulin 15

4. Persiapan insulin 24

5. Metode produksi, standardisasi dan pengendalian kualitas sediaan insulin 31

6. Penggunaan HPLC dalam analisis farmasi insulin. 46

BAB 2. Pernyataan Masalah 50

BAB 3. Studi pengaruh berbagai faktor pada perilaku kromatografi insulin dalam kondisi RP HPLC 56

1. Metode dan bahan 57

2. Diskusi hasil 62

2.1. Pengaruh komposisi larutan buffer 62

2.2. Efek konsentrasi natrium sulfat 68

2.3. Pengaruh suhu kolom kromatografi 70

2.4. Efek Pengubah Organik 75

2.5. Pengaruh panjang radikal alkil dari fase cangkok 80

2.6. Pengaruh panjang kolom kromatografi 80

BAB 4. Meningkatkan metode farmakope untuk menganalisis preparat insulin berdasarkan penggunaan RP HPLC 82

1. Pemilihan kondisi optimal untuk penentuan kromatografi insulin dan kotorannya dalam sediaan obat 82

2. Karakteristik metrologi dari metode 84

3. Penerapan metodologi yang dikembangkan untuk menguji sediaan insulin resmi 95

BAB 5. Pengembangan metode untuk analisis bentuk sediaan suntik isopan-insulin berdasarkan metode PF HPLC 107

1. Pilihan kondisi untuk penentuan kromatografi protamin dalam bentuk sediaan isophane-insulin 110

2. Studi profil kromatografi protamine yang diisolasi dari berbagai spesies ikan 121

3. Metode untuk penentuan protamin dalam sediaan isophane-insulin 123

4. Validasi metodologi yang dikembangkan 125

Kesimpulan umum 136

Referensi 139

Karakteristik umum dari sifat fisikokimia dan farmasi insulin

Dari sudut pandang kimia, insulin adalah protein globular kecil dengan berat molekul hingga 6000 Da. Pada saat yang sama, harus dicatat bahwa insulin adalah nama umum untuk seluruh keluarga protein homolog asal alami dan buatan dengan aktivitas biologis karakteristik umum. Sifat protein insulin didirikan pada tahun 1928 [52]. Ini adalah salah satu protein yang menghasilkan reaksi biuret dan reaksi Pauli. Struktur insulin sepenuhnya didirikan pada awal 50-an. Komposisi kimiawi dasar insulin dari berbagai asal ditandai oleh angka-angka yang diberikan dalam tabel 1 [40].

Komposisi asam amino. Sebagian besar molekul insulin mengandung 51 residu asam amino, di antaranya adalah 17 asam amino yang ditemukan dalam protein yang paling dikenal.

Ciri khas komposisi asam amino dari sapi, babi, dan insulin manusia adalah triptofan dan metionin. Komposisi asam amino dari jenis insulin ini disajikan pada tabel 2 [40,46].

Tidak berbeda dengan semua jenis insulin adalah kandungan sistin (6 residu setengah sistin). Selain itu, molekul insulin dari semua jenis mengandung 6 kelompok amida (asparagin, glutamin).

Ketika insulin dilepaskan, bersama dengan fraksi utama, fraksi-fraksi dari bentuk-bentuk insulin yang tidak jelas dapat diamati. Dalam lingkungan asam, dalam proses deamidasi, semua 6 kelompok amida dapat secara bertahap dipisahkan, dan mobilitas elektroforetik dan kromatografi perubahan insulin [40]. Pembentukan bentuk insulin yang dideamidasikan dapat dinilai dari hasil penentuan amonia. Untuk bentuk sepenuhnya amida dari insulin, 6 mol amonia per 1 mol protein ditentukan, untuk bentuk yang terdeamidasi, nilai ini mungkin dari 5 hingga 0.

Struktur utama insulin. Struktur utama insulin diuraikan oleh kelompok Sanger pada tahun 1945-1955. Menggunakan sejumlah metode kromatografi yang memungkinkan untuk memisahkan dan mengidentifikasi berbagai peptida, asam amino dan turunannya, Sanger mampu membangun struktur utama insulin sapi [130.131.113.133.133.144.135]. Studi lebih lanjut tentang insulin dari berbagai asal menggunakan berbagai metode fisikokimia, termasuk metode Edman untuk menentukan urutan asam amino penuh dalam peptida panjang, mengkonfirmasi temuan Sanger dan rekan penulis pada struktur insulin [bb].

Sampai saat ini, struktur utama insulin telah ditentukan dalam perwakilan dari 24 spesies yang termasuk dalam 4 kelas hewan: mamalia, burung, ikan, dan cyclostoma [14]. Penelitian tentang insulin dari berbagai asal terus [71,72,73].

Struktur insulin pada hewan yang berbeda serupa, tetapi tidak identik. Dalam struktur utamanya, insulin manusia mirip dengan babi, anjing, paus sperma, dan insulin, hanya berbeda dalam satu asam amino [40]. Ini berbeda dari insulin sapi dengan tiga asam amino. Pada tingkat yang lebih besar, insulin manusia tidak mirip dengan insulin dari babi, burung, dan ikan Guinea [40]. Perbedaan dalam urutan asam amino insulin manusia, babi, dan sapi ditunjukkan pada Tabel 3.

Meskipun terdapat perbedaan struktural, semua jenis insulin memiliki aktivitas biologis yang serupa, yaitu. menyebabkan efek hipoglikemik. Namun, besarnya aktivitas biologis yang ditampilkan sangat tergantung pada spesies dan berada pada kisaran 11 IU / mg (cod cod dari Laut Utara) hingga 62 IU / mg (insulin kalkun dan ayam), sedangkan aktivitas insulin manusia sekitar 25-30 IU / mg [40]. Semakin besar perbedaan antarspesies, semakin besar perbedaan dalam aktivitas biologis dari insulin yang sesuai.

Molekul insulin yang aktif secara fungsional terdiri dari dua rantai polipeptida (rantai A dan B) yang dihubungkan oleh ikatan disulfida; satu ikatan dibentuk oleh residu asam amino ketujuh dari kedua rantai, ikatan disulfida kedua dibentuk oleh residu ke-20 dari rantai-A dan residu ke-19 dari rantai-B (Gambar 2). Selain itu, ada ikatan disulfida ketiga dalam molekul insulin, yang merupakan intrachain dan menghubungkan residu rantai-A ke-6 dan ke-11 [59.117].

Struktur sekunder Menggunakan berbagai metode penelitian fisikokimia dan fisik, ditunjukkan bahwa molekul insulin memiliki struktur tata ruang yang sangat teratur (konformasi), yang berkontribusi pada implementasi fungsi biologis spesifik [14]. Dalam molekul insulin asli, lembaran cc-helix dan p-fold hadir secara bersamaan. Selain itu, ada area dengan struktur dan struktur yang tidak teratur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Ketika larutan asam insulin (pH 2,3-2,5) dipanaskan pada suhu +100 ° C dan didinginkan dengan cepat hingga -80 ° C, insulin fibrilar yang terbentuk terbentuk - suatu bentuk hormon yang sama sekali tidak aktif [27]. Pengenalan serat insulin fibrilar ke dalam solusi insulin aktif menyebabkan pengendapan kuantitatif spontan insulin dalam bentuk fibril [14,17].

Metode produksi, standardisasi dan kontrol kualitas preparat insulin

Memperoleh spesies insulin hewan. Produksi industri insulin daging sapi dan babi didirikan hampir secara bersamaan di sejumlah negara, segera setelah penemuan insulin pada tahun 1921 [63]. Sejak itu, konsep memperoleh insulin tetap hampir tidak berubah (tabel b) [17, 18]. Bahan baku untuk produksi spesies hewan dari insulin adalah pankreas dari sapi potong yang digunakan untuk makanan.

Tugas paling penting dalam produksi insulin adalah pemurniannya - pelepasan zat dari pengotor terkait, yang mengurangi aktivitas biologis, menyebabkan reaksi imunologis, atau berpotensi berbahaya bagi kesehatan pasien. Sebagai contoh, setelah beberapa tahun menggunakan insulin yang dimurnikan dengan buruk dalam darah pasien, mungkin ada hingga 5.000 IU insulin yang terikat dengan antibodi. Antibodi terhadap insulin secara signifikan mempengaruhi profil aksinya dan, dengan demikian, berkontribusi pada perjalanan diabetes yang labil.

Metode pertama pemurnian insulin adalah rekristalisasi dengan adanya garam seng. Pada tahun 1945, ditunjukkan bahwa tujuh kali rekristalisasi insulin secara signifikan mengurangi tingkat reaksi alergi pada pasien, dibandingkan dengan persiapan insulin resmi pada waktu itu [63].

Heterogenitas sampel insulin setelah kristalisasi dan rekristalisasi tunggal ditunjukkan dengan menggunakan berbagai metode: ekstraksi arus balik (PE), kromatografi distribusi (PX), kromatografi penukar ion (IOC), diskelectrophoresis (DEP) dan kromatografi eksklusi gel (GEC) [63].

Ditemukan bahwa pengotor insulin yang terjadi secara bersamaan adalah: proinsulin, zat antara, dimer kovalen insulin, insulin mono-disamido, monoarginine dan mono-etilena, serta sejumlah senyawa molekul tinggi yang bersifat non-insulin. Kesimpulan umum dari hasil penelitian, dengan mempertimbangkan informasi tentang aktivitas imunologis dari kotoran yang terdeteksi [138], adalah kesimpulan tentang perlunya pemurnian tambahan zat insulin, sehingga ketika menganalisis dengan metode DEF dan GEC, satu komponen ditemukan - insulin yang sesuai.

Untuk mengatasi masalah pemurnian insulin pada tahun 1950, metode HEC diusulkan, dan pada tahun 1970, metode anion exchange chromatography (AOX). Ditemukan bahwa insulin, dimurnikan dengan metode AOX, mengandung sekitar 500 ppm (bagian per juta) pengotor dengan aktivitas proinsulin [137]. Pemurnian tambahan insulin menggunakan kromatografi cair tekanan tinggi pada fase terbalik (RP HPLC) mengurangi kandungan fraksi imunogenik hingga batas deteksi mereka [63].

Tinjauan perkembangan saat ini di bidang pemurnian kromatografi insulin disajikan dalam [96]. Insulin, dimurnikan, secara berurutan, menggunakan IOC dan GEC, disebut insulin monokomponen [63]. Mendapatkan insulin manusia. Pencarian metode untuk mendapatkan insulin manusia disebabkan oleh dua keadaan. Di satu sisi, urgensi masalah bahan baku dalam hal produksi insulin hewan, di sisi lain, pesatnya perkembangan ilmu pengetahuan di bidang ini memberikan peluang nyata untuk menghidupkan gagasan itu. Pada 1979 dan 1981 hampir secara bersamaan, dua metode untuk mendapatkan insulin manusia dikembangkan - biosintetik dan semi-sintetik [102.108]. Pada 1981, perusahaan Novo Nordisk untuk pertama kalinya di dunia memulai produksi serial insulin semi-sintetis manusia. Metode yang digunakan oleh perusahaan didasarkan pada penggantian enzimatik dan kimiawi Al dalam molekul insulin babi dengan sisa Tre [61]. Metode ini secara langsung tergantung pada perolehan jumlah insulin babi yang diperlukan, yang mengurangi nilai ekonomisnya. Kemungkinan memperoleh insulin manusia dengan metode biosintesis muncul dengan perkembangan teknologi DNA rekombinan [10]. Pekerjaan pada produksi insulin rekayasa genetika dimulai sekitar 25 tahun yang lalu. Pada tahun 1978, dilaporkan bahwa strain proinsou-ling tikus penghasil E. coli diperoleh. Pada tahun 1979, penelitian Genentech mampu mengkloning ke E. coli gen yang mengkode urutan asam amino. rantai A dan B insulin, termasuk dalam wilayah p-haloctosidase dari plasmid pBR322 [10,102]. Pada tahun 1981, sebuah gen-analog proinsulin mini-C-proinsulin disintesis, di mana 35-anggota C-peptida digantikan oleh segmen enam asam amino: arg-arg-gly-ser-lys-arg dan ekspresinya dalam E. coli ditunjukkan. Pada tahun 1982, Eli Lilly memulai produksi insulin manusia industri pertama di dunia menggunakan teknologi dua rantai yang dikembangkan bekerja sama dengan Genentech [102]. Saat ini, kemungkinan memperoleh insulin manusia dengan bantuan berbagai sistem ekspresi telah ditunjukkan [3,10,101,102]. Dari sudut pandang ekonomi, penggunaan turunan bakteri E.coli gram positif yang dimodifikasi secara genetik, banyak di antaranya dianggap overproduser, merupakan hal yang menarik [3]. Pada saat yang sama, kemajuan signifikan dicapai dengan sel ragi Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabel 7 daftar utama, umum untuk berbagai metode produksi insulin manusia rekombinan, tahapan proses teknologi [3,10,63].

Penerapan metodologi yang dikembangkan untuk menguji persiapan insulin resmi

Kromatografi cair tekanan tinggi (HPLC) adalah varian kromatografi cair kolom di mana fase gerak - eluen - melewati sorben yang mengisi kolom dengan kecepatan tinggi karena tekanan yang signifikan (hingga 400x105 Pa) di pintu masuk kolom [11].

Sebagai cara untuk menganalisis campuran zat yang kompleks, HPLC muncul sedikit lebih dari 30 tahun yang lalu. Penggunaan sorben dengan diameter partikel 3–10 μm menyebabkan peningkatan tajam dalam efisiensi pemisahan kromatografi dibandingkan dengan versi klasik dari kromatografi cair kolom. Oleh karena itu, HPLC sering disebut sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Fitur instrumental dari penggunaan HPLC dijelaskan secara rinci dalam berbagai manual [49,50] dan di bagian yang relevan dari farmakope terkemuka [79.150]. Untuk HPLC, berbagai sorben telah dikembangkan dan diproduksi. Menurut penulis survei [51] - sekitar 100 perusahaan di seluruh dunia menghasilkan lebih dari 300 jenis nama sorben. Sejarah, kondisi saat ini, dan prospek pengembangan metode dibahas dalam ulasan [51] dan [77,78].

Dalam berbagai variannya, metode HPLC banyak digunakan dalam analisis farmasi (kontrol produksi dan pengujian kualitas obat). Metode ini termasuk dalam semua farmakope terkemuka di dunia. Metode ini paling lengkap dijelaskan dalam Farmakope Eropa dan Amerika. HPLC digunakan untuk mengidentifikasi obat-obatan, untuk menentukan kemurnian, komposisi fraksi berat molekul dan analisis kuantitatif. Di US Pharmacopoeia 28 ed. sekitar 30% artikel pribadi melibatkan penggunaan HPLC. Di European Pharmacopoeia edisi ke-4. angka ini sekitar 40%.

Metode kromatografi pertama untuk pengujian insulin adalah kromatografi cair eksklusi gel tekanan rendah (GE ZhND). Prinsip pemisahan dalam kondisi HPLC didasarkan pada kemampuan berbeda dari molekul dengan ukuran yang berbeda untuk menembus ke dalam pori-pori gel netral, yang berfungsi sebagai fase diam. Diameter hidrodinamik dari monomer dan dimer insulin sebanding dengan berat molekulnya dan masing-masing adalah 2,69 dan 5,50 nm [115].

Pada tahun 1967, menggunakan metode GE-IHDD, ditunjukkan bahwa preparat komersial insulin, dimurnikan dengan kristalisasi, mengandung pengotor dengan berat molekul melebihi berat molekul insulin [63]. Pada kromatogram insulin babi, tiga puncak ditemukan, secara konvensional ditetapkan sebagai komponen a, b, dan c. Sejak itu, sejumlah sistem kromatografi telah diusulkan untuk mengontrol kandungan pengotor berat molekul tinggi dalam sediaan insulin. Pemisahan ini dilakukan pada xerogel agarosa yang sangat bengkak (Bio-Gel P-30, Lab Bio-Rad.) Atau dekstran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), larutan asam asetat 1-3 M digunakan sebagai IF [127]. Sensitivitas yang tinggi dari sorben ini terhadap kompresi pada tekanan yang melebihi tekanan pembengkakan matriks membuat bahan-bahan ini tidak cocok untuk operasi dalam mode HPLC.

Penggunaan kromatografi cair eksklusi gel pada tekanan tinggi (GE HPLC) untuk analisis insulin pertama kali dideskripsikan pada tahun 1980, setelah pengembangan penyerap makropori keras yang kompatibel dengan air dan menahan tekanan tinggi. Pada [151], pemisahan dilakukan pada kolom Protein-Pak 1-125 (Perairan), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp), Bondagel (Pharmacia) dalam kondisi denaturasi (kombinasi larutan 7 M urea, asam mineral dan non-ionik) deterjen). Kebutuhan untuk analisis insulin dalam kondisi denaturasi dikaitkan dengan kemampuan insulin untuk agregat dalam larutan. Untuk pemisahan insulin dalam kondisi HPLC HPLC, penggunaan asam asetat eluen "tradisional" juga telah dijelaskan [152]. Penggunaan asam asetat memiliki beberapa keuntungan - dampak minimal pada struktur asli dari senyawa yang dipisahkan, ketersediaan, biaya rendah, di samping itu, fakta penting adalah kemampuan asam asetat untuk menekan asosiasi insulin.

Saat ini, GE HPLC adalah metode farmakope untuk memantau konten pengotor berat molekul tinggi dalam zat dan bentuk sediaan jadi. Metode ini juga digunakan untuk menentukan kandungan protamin dalam sediaan isophane-insulin.

Penggunaan HPLC pada fase terbalik (RP HPLC) untuk pemisahan sapi dan insulin babi untuk pertama kalinya menunjukkan efisiensi tinggi metode ini untuk analisis peptida mirip insulin dengan struktur yang sama.

Mekanisme pemisahan protein dan polipeptida dalam kondisi RP HPLC didasarkan pada perbedaan hidrofobik molekul insulin dan pengotor terkait. Sampai saat ini, beberapa lusinan metode untuk pemisahan kromatografi insulin dari berbagai asal dan turunannya, termasuk proin-sulin, polipeptida pankreas, turunan dezamido, dimer insulin, telah dijelaskan. [126] menunjukkan kemungkinan memisahkan insulin ayam, kelinci, domba, dan kuda. Insulin manusia, daging sapi dan babi juga dipisahkan. Lloyd dan Corran menerbitkan sebuah metode untuk memisahkan daging sapi, babi, insulin manusia dan bentuk-bentuk deamidasinya yang sesuai [104].

Pemisahan dilakukan pada sorben silika gel yang dimodifikasi, metil, butil, oktil, oktadil, dan gugus fenil dalam mode isokratik atau gradien. Sebagai PF, pengubah organik digunakan - asetonitril, metil alkohol, alkohol isopropil, dicampur dengan larutan buffer berair yang mengandung garam anorganik dan pereaksi ion-uap. Deteksi puncak dilakukan terutama oleh metode spektrofotometri pada panjang gelombang 190-220 nm, metode fluorimetri juga dijelaskan [103].

Analisis zat dan bentuk sediaan insulin menggunakan RP HPLC dijelaskan dalam artikel pribadi di Farmakope Amerika dan Eropa [79.150]. Metode ini digunakan untuk menguji obat dari kelompok tertentu dalam hal "Keaslian Insulin", "Protein Terkait", "Penentuan Kuantitatif" dan "Insulin dalam Larutan".

Literatur penelitian juga menjelaskan penggunaan pertukaran ion dan kromatografi afinitas untuk analisis insulin [44,102], namun metode ini belum banyak digunakan dalam praktik farmakope.

Pilihan kondisi untuk penentuan kromatografi protamin dalam bentuk sediaan isophane-insulin

Peningkatan kekuatan ion PF biasanya mengarah pada peningkatan rasio kapasitas insulin, yang dapat disebabkan oleh sejumlah faktor: - meningkatkan konsentrasi ion mengurangi tingkat ionisasi kelompok bermuatan molekul protein, meningkatkan hidrofobisitasnya - - kation konsentrasi tinggi berkontribusi untuk menyaring kelompok silanol bebas di permukaan. fase yang melemahkan interaksi elektrostatik non-spesifik dari gugus protein protonasi protein dengan matriks; - Kekuatan ionik yang tinggi mempengaruhi struktur spasial insulin, akibatnya permukaan yang tersedia untuk interaksi dengan perubahan sorben. Konsentrasi garam anorganik dalam FS mempengaruhi bentuk puncak dan selektivitas pemisahan insulin dan desamido-Asn-insulin [143.144]. Dengan elusi isokratis pada sorben LiChrosorb Сів dengan larutan natrium fosfat 0,1 M (pH 2,3), hasil yang memuaskan hanya tercapai ketika natrium sulfat ditambahkan ke larutan buffer ke konsentrasi 0,1 M. Kebanyakan metode analisis insulin termasuk dalam artikel farmakope dan ND, gunakan PF berdasarkan larutan buffer dengan kandungan natrium sulfat yang sama dengan 0,2 M. Kandungan natrium sulfat yang tinggi secara negatif mempengaruhi reproduktifitas hasil kromatografi karena stratifikasi eluen, apalagi, larutan garam sangat pekat memiliki efek negatif pada peralatan kromatografi, memperpendek umur layanannya. Menimbang bahwa metode analisis farmakope dikembangkan lebih dari 20 tahun yang lalu, tampaknya menarik untuk mempelajari perilaku kromatografi insulin di bawah OF-HPLC pada sorben kromatografi generasi terbaru, tergantung pada konsentrasi natrium sulfat. Pada saat yang sama, mereka mencoba mencari tahu apakah pengurangan kadar natrium sulfat dalam PF diperbolehkan tanpa penurunan yang signifikan dalam kemampuan pemisahan sistem kromatografi. Sebagai hasil penelitian ditemukan bahwa efek konsentrasi natrium sulfat dalam PF berbeda, tergantung pada jenis fase yang dicangkokkan, serta pada spesies insulin. Pada sorben dengan kelompok cangkokan C4 dan C selektivitas pemisahan puncak insulin manusia dan insulin desamido-Asn-manusia tidak bergantung pada konsentrasi natrium sulfat di Indonesia. larutan buffer1 dalam kisaran dari 0,05 M hingga 0,2 M. Pada sorben Diaspher-110-C18, selektivitas pemisahan pasangan puncak ini memiliki maksimum pada 0,05 M dan minimum pada 0,1 M (grafik 4). Di sisi lain, selektivitas pemisahan spesies hewan dari insulin dan bentuk AsnA21 desamidasinya yang sesuai tidak tergantung pada kekuatan ion larutan ketika dipisahkan pada sorben Diasphere-110-C18. Pada sorben dengan gugus C8, selektivitas meningkat dari 1,25 menjadi 1,28 dengan peningkatan konsentrasi natrium sulfat (gambar 4). Pada sorben dengan kelompok c4 yang dicangkokkan, selektivitas pemisahan dalam kasus insulin sapi maksimum pada 0,1 M natrium sulfat dan minimum 0,2 M. Untuk insulin babi, tidak ada maksimum yang diucapkan pada konsentrasi natrium sulfat 0,1 M, dalam hal ini peningkatan ionik kekuatan menyebabkan penurunan selektivitas pemisahan (gambar 4). Jumlah pelat teoritis efektif meningkat dengan meningkatnya konsentrasi natrium sulfat. Pengecualian adalah perilaku insulin manusia pada sorben Diasfer-110-C8 (gambar 5). Tingkat pemisahan puncak insulin dan desamido-Asn-insulin meningkat dengan peningkatan kekuatan ion FS, terlepas dari spesies insulin dan jenis fase yang dicangkokkan (diagram b). Dengan mengurangi konsentrasi natrium sulfat dari 0,2 M menjadi 0,1 M, tingkat pemisahan pasangan yang dipilih menurun rata-rata sebesar 5% untuk insulin manusia dan babi, dan sebesar 10% untuk insulin daging sapi. Mempertimbangkan fakta bahwa nilai absolut dari tingkat pemisahan melebihi 2.0, deteriorasi terukur dalam kapasitas pemisahan kolom, menurut pendapat kami, tidak signifikan. Akibatnya, konsentrasi natrium sulfat dalam larutan buffer PF dapat dikurangi 2 kali dibandingkan dengan metode analisis farmakope.

Dalam kebanyakan studi tentang analisis protein dan peptida, pemisahan dilakukan pada suhu kamar. Selain itu, beberapa penulis menunjukkan bahwa efek suhu pada selektivitas pemisahan minimal [48]. Namun, dengan meningkatnya suhu, proses pertukaran massa antara fase diam dan fase gerak dipercepat, yang mengarah pada penurunan waktu retensi peptida dan penyempitan puncak.

Teknologi Insulin

Pelanggaran sekresi insulin. Penggunaan fotografi afiliasi. Skema untuk insulin. Ekspresi proinsulin dalam sel E. coli. Pendekatan untuk memecahkan masalah diabetes. Kontribusi bioteknologi untuk produksi industri hormon non-peptida.

Kirim pekerjaan baik Anda di basis pengetahuan sederhana. Gunakan formulir di bawah ini.

Siswa, mahasiswa pascasarjana, ilmuwan muda yang menggunakan basis pengetahuan dalam studi dan pekerjaan mereka akan sangat berterima kasih kepada Anda.

Diposting pada http://www.allbest.ru/

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN ILMU PENGETAHUAN REPUBLIK KAZAKHSTAN

KAZAKH AGRO-TECHNICAL UNIVERSITY NAMED SETELAH S.SEYFULLIN

Departemen Mikrobiologi dan Bioteknologi

Pada disiplin "Bioteknologi mokroorganizmov"

Pada topik: teknologi untuk insulin

Selesai: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Diperiksa: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

SINGKATAN DAN SIMBOL

1. Sejarah penemuan

2. Mendapatkan insulin dalam bioteknologi

3. Cara mendapatkan insulin manusia

4. Ekspresi proinsulin dalam sel E. coli

5. Pemurnian insulin

6. Dosis dan pemberian

Dalam kursus ini digunakan definisi berikut:

Pembawa protein - menyediakan transportasi protein hibrida dalam ruang periplasmik sel atau media kultur;

Komponen afinitas - secara signifikan memfasilitasi pemilihan protein hibrida.

Insulin (dari bahasa Latin. Insula - pulau) - suatu hormon peptida, terbentuk dalam sel beta pulau Langerhans di pankreas.

Interleukin adalah sekelompok sitokin yang disintesis terutama oleh leukosit (untuk alasan ini, akhiran “-leukin” dipilih).

Proinsulin adalah prekursor insulin yang disintesis oleh sel-sel B dari peralatan insuler pankreas.

Kromatografi (dari bahasa Yunani. Chroma, chromatos - warna, cat), metode pemisahan fisik-kimia dan analisis campuran, berdasarkan pada distribusi komponen mereka di antara dua fase - stasioner dan bergerak (eluen), mengalir melalui stasioner.

Enkapsulasi - suatu mekanisme bahasa pemrograman yang membatasi akses ke komponen-komponen yang membentuk suatu objek (metode dan properti), menjadikannya privat, yaitu hanya dapat diakses dalam suatu objek.

Protein fusi (fusionprotein, juga protein senyawa chimeric) adalah protein yang diperoleh dengan menggabungkan dua atau lebih gen yang awalnya menyandikan protein terpisah.

Hormon (dari bahasa Yunani. Hormao - menggerakkan, menginduksi), hormon, zat aktif biologis yang diproduksi oleh kelenjar endokrin atau kelenjar endokrin, dan disekresikan oleh mereka langsung ke dalam darah.

Diabetes mellitus adalah sekelompok penyakit endokrin, yang berkembang sebagai akibat dari kekurangan relatif atau relatif dari hormon insulin.

Somatostatin adalah hormon sel-sel delta di pulau pankreas Langerhans, serta salah satu hormon hipotalamus.

Analisis radioimmune adalah metode untuk penentuan kuantitatif zat aktif biologis (hormon, enzim, obat-obatan, dll.) Dalam cairan biologis, berdasarkan pada pengikatan kompetitif dari kandang yang diinginkan dan mirip dengan mereka zat berlabel radionuklida dengan sistem pengikatan spesifik.

SINGKATAN DAN SIMBOL

HPLC - Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

cDNA - asam deoksiribonukleat komplementer

Fungsi utama insulin adalah untuk memastikan permeabilitas membran sel untuk molekul glukosa. Dalam bentuk yang disederhanakan, dapat dikatakan bahwa tidak hanya karbohidrat, tetapi juga nutrisi apa pun, pada akhirnya, dipecah menjadi glukosa, yang digunakan untuk mensintesis molekul yang mengandung karbon lainnya, dan merupakan satu-satunya jenis bahan bakar untuk pembangkit listrik seluler - mitokondria. Tanpa insulin, permeabilitas membran sel terhadap glukosa turun 20 kali lipat, dan sel-sel mati kelaparan, dan kelebihan gula yang larut dalam darah meracuni tubuh.

Gangguan sekresi insulin akibat kerusakan sel beta - defisiensi insulin absolut - adalah elemen kunci dalam patogenesis diabetes mellitus tipe 1. Pelanggaran efek insulin pada jaringan - defisiensi insulin relatif - memiliki tempat penting dalam perkembangan diabetes tipe 2.

Penggunaan kromatografi afinitas telah secara signifikan mengurangi kandungan protein yang terkontaminasi dalam preparasi dengan berat molekul yang lebih tinggi daripada insulin. Protein semacam itu termasuk proinsulin dan proinsulin yang dibelah sebagian, yang mampu menginduksi produksi antibodi antiinsulin.

Penggunaan insulin manusia sejak awal terapi meminimalkan terjadinya reaksi alergi. Insulin manusia diserap lebih cepat dan, terlepas dari bentuk obatnya, memiliki durasi kerja yang lebih pendek daripada insulin hewan. Insulin manusia lebih sedikit imunogennya daripada babi, terutama insulin campuran bovine dan porcine.

Tujuan dari kursus ini adalah mempelajari teknologi insulin. Untuk mencapai tujuan-tujuan berikut telah ditetapkan:

1. mendapatkan insulin dalam bioteknologi

2. Cara mendapatkan insulin

H. Pemurnian Insulin

Sejarah penemuan insulin dikaitkan dengan nama dokter Rusia I.M. Sobolev (paruh kedua abad ke-19), yang membuktikan bahwa kadar gula dalam darah manusia diatur oleh hormon khusus pankreas.

Pada tahun 1922, insulin yang diisolasi dari pankreas seekor hewan diperkenalkan pada bocah laki-laki berusia sepuluh tahun untuk pertama kalinya, seorang pasien diabetes melampaui semua harapan, dan setahun kemudian perusahaan Amerika Eli Lilly merilis persiapan insulin hewan pertama.

Setelah menerima batch industri pertama dari insulin dalam beberapa tahun ke depan cara besar isolasi dan pemurnian telah ditutup. Akibatnya, hormon menjadi tersedia untuk pasien dengan diabetes tipe 1.

Pada tahun 1935, peneliti Denmark, Hagedorn, mengoptimalkan kerja insulin dalam tubuh dengan mengusulkan obat yang berkepanjangan.

Kristal insulin pertama diperoleh pada tahun 1952, dan pada tahun 1954, ahli biokimia Inggris G. Senger menguraikan struktur insulin. Pengembangan metode pemurnian hormon dari zat-zat hormonal lainnya dan produk-produk degradasi insulin memungkinkan untuk mendapatkan insulin homogen, yang disebut insulin komponen tunggal.

Di awal 70-an. Ilmuwan Soviet A. Yudaev dan S. Shvachkin mengusulkan sintesis kimia insulin, namun implementasi sintesis ini pada skala industri mahal dan tidak menguntungkan.

Di masa depan, ada peningkatan progresif dalam tingkat pemurnian insulin, yang mengurangi masalah yang disebabkan oleh alergi insulin, gangguan fungsi ginjal, gangguan penglihatan dan resistensi insulin imun. Hormon yang paling efektif diperlukan untuk terapi substitusi pada diabetes mellitus - insulin homolog, yaitu insulin manusia.

Pada tahun 80-an, kemajuan dalam biologi molekuler memungkinkan untuk mensintesis kedua rantai insulin manusia menggunakan E.coli, yang kemudian digabungkan menjadi molekul hormon yang aktif secara biologis, dan insulin rekombinan diperoleh dengan menggunakan galur E.coli yang direkayasa secara genetika di Institut Kimia Bioorganik.

2. Mendapatkan insulin dalam bioteknologi

Insulin, hormon peptida dari pulau pankreas Langerhans, adalah pengobatan utama untuk diabetes mellitus. Penyakit ini disebabkan oleh kekurangan insulin dan dimanifestasikan oleh peningkatan kadar glukosa darah. Sampai saat ini, insulin diperoleh dari pankreas sapi jantan dan babi. Obat itu berbeda dengan substitusi insulin 1-3 asam amino manusia, sehingga ada ancaman reaksi alergi, terutama pada anak-anak. Penggunaan terapi insulin dalam skala besar terhambat oleh biaya tinggi dan sumber daya yang terbatas. Dengan modifikasi kimia, insulin dari hewan dibuat tidak dapat dibedakan dari manusia, tetapi ini berarti peningkatan tambahan dalam biaya produk. [1]

Sejak 1982, Eli Lilly telah memproduksi insulin rekayasa genetika berdasarkan sintesis terpisah E. colie - dan rantai-B. Biaya produk telah menurun secara signifikan, insulin yang diproduksi identik dengan manusia. Sejak 1980, telah ada laporan di media tentang kloning gen proinsulin, prekursor hormon, yang beralih ke bentuk dewasa dengan proteolisis terbatas.

Teknologi enkapsulasi juga melekat pada pengobatan diabetes: sel-sel pankreas dalam kapsul, dimasukkan sekali ke dalam tubuh pasien, menghasilkan insulin dalam setahun.

Integrated Genetics telah meluncurkan produksi hormon yang menstimulasi folikel dan luteinizing. Peptida ini terdiri dari dua subunit. Dalam agenda adalah pertanyaan sintesis industri hormon oligopeptida sistem saraf, ankephalins, dibangun dari 5 residu asam amino, dan endorfin, analog morfin. Dengan penggunaan peptida ini secara rasional mengurangi rasa sakit, menciptakan suasana hati yang baik, meningkatkan efisiensi, memusatkan perhatian, meningkatkan daya ingat, mengatur tidur dan bangun. Contoh keberhasilan penerapan metode rekayasa genetika adalah sintesis β-endorphin menggunakan teknologi protein hibrida yang dijelaskan di atas untuk hormon peptida lain, somatostatin [2].

3. Cara mendapatkan insulin manusia

Secara historis, cara pertama untuk mendapatkan insulin untuk tujuan terapeutik adalah dengan mengisolasi analog hormon ini dari sumber alami (pulau pankreas sapi dan babi). Pada 20-an abad terakhir, ditemukan bahwa insulin dan babi (yang paling dekat dengan insulin manusia dalam struktur dan urutan asam amino) menunjukkan aktivitas dalam tubuh manusia yang sebanding dengan insulin manusia. Setelah itu, insulin bovine atau porcine digunakan untuk waktu yang lama untuk merawat pasien dengan diabetes tipe 1. Namun, setelah beberapa waktu, ditunjukkan bahwa dalam beberapa kasus, antibodi terhadap insulin bovine dan porcine mulai menumpuk di tubuh manusia, sehingga menghilangkan efeknya.

Di sisi lain, salah satu keuntungan dari metode mendapatkan insulin ini adalah ketersediaan bahan baku (insulin sapi dan babi dapat dengan mudah diperoleh dalam jumlah besar), yang memainkan peran penting dalam pengembangan metode pertama untuk mendapatkan insulin manusia. Metode ini disebut semi-sintetik [3].

Dalam metode ini memproduksi insulin manusia, insulin babi digunakan sebagai bahan baku. Insulin babi yang dimurnikan dibelah oleh C-terminal octapeptide dari rantai-B, setelah itu C-terminal octapeptide dari insulin manusia disintesis. Kemudian secara kimia melekat, kelompok-kelompok pelindung dihilangkan dan insulin yang diperoleh dimurnikan. Saat menguji metode mendapatkan insulin ini, identitas lengkap hormon yang diperoleh insulin manusia ditunjukkan. Kerugian utama dari metode ini adalah tingginya biaya insulin yang dihasilkan (bahkan sekarang sintesis kimia octapeptide mahal, terutama pada skala industri).

Saat ini, insulin manusia terutama diperoleh dengan dua cara: dengan memodifikasi insulin babi dengan metode sintetis-enzimatik dan dengan metode rekayasa genetika.

Dalam kasus pertama, metode ini didasarkan pada kenyataan bahwa insulin babi berbeda dari insulin manusia dengan substitusi tunggal pada terminal-C dari rantai-B Ala30Thr. Penggantian alanin dengan treonin dilakukan oleh pembelahan alanin yang dikatalisis oleh enzim dan, sebagai gantinya, menempelkan residu treonin yang dilindungi karboksil yang ada dalam campuran reaksi dalam jumlah besar. Setelah pembelahan kelompok pelindung O-tert-butil, insulin manusia diperoleh. (gambar 1)

Gambar 1 - Diagram metode untuk memproduksi insulin manusia

Insulin adalah protein pertama yang diperoleh untuk tujuan komersial menggunakan teknologi DNA rekombinan. Ada dua pendekatan utama untuk mendapatkan insulin manusia yang direkayasa secara genetis. Dalam kasus pertama, terpisah (galur produsen berbeda) menghasilkan kedua rantai diikuti oleh pelipatan molekul (pembentukan jembatan disulfida) dan pemisahan misoform. Pada tahap kedua, persiapan dalam bentuk prekursor (proinsulin) diikuti oleh pembelahan enzimatik dengan trypsin dan carboxypeptidase. Ke dalam bentuk aktif hormon. Yang paling disukai saat ini adalah produksi insulin sebagai prekursor, memastikan penutupan yang benar dari jembatan disulfida (dalam hal produksi rantai terpisah, siklus denaturasi berturut-turut, pemisahan misoform dan renaturasi dilakukan [3].

Dalam kedua pendekatan, dimungkinkan secara individual untuk mendapatkan komponen awal (rantai A dan B atau proinsulin), dan sebagai bagian dari protein hibrid. Selain A-dan B-rantai atau proinsulin, mungkin ada dalam komposisi protein hibrida:

1) protein pembawa - memastikan transportasi protein hibrida ke ruang periplasmik sel atau media kultur;

2) komponen afinitas - secara signifikan memfasilitasi pemilihan protein hibrida.

Pada saat yang sama, kedua komponen ini dapat secara bersamaan hadir dalam komposisi protein hibrida. Selain itu, ketika membuat protein hibrida, prinsip multidimensi dapat digunakan (yaitu, beberapa salinan polipeptida target terdapat dalam protein hibrid), yang memungkinkan untuk secara signifikan meningkatkan hasil produk target [4].

Kami menggunakan strain JM 109 N1864 dengan urutan nukleotida yang tertanam dalam plasmid yang mengekspresikan protein hibrida, yang terdiri dari proinsulin linier dan sebuah fragmen dari fragmen protein Astaphylococcusaureus yang melekat pada terminal N-nya melalui residu metionin. Penanaman biomassa jenuh sel-sel dari strain rekombinan memastikan dimulainya produksi protein hibrida, isolasi dan transformasi sekuensial yang oleh intube mengarah ke insulin. Kelompok peneliti lain menerima dalam sistem ekspresi bakteri protein rekombinan fusi yang terdiri dari proinsulin manusia dan ekor polyhistidine yang melekat padanya melalui residu metionin. Itu diisolasi menggunakan kromatografi kelat pada kolom Ni-agarose dari badan inklusi dan dicerna dengan cyanogen bromide. Para penulis menentukan bahwa protein yang diisolasi adalah S-sulfurisasi. Pemetaan dan analisis spektrometri massa dari proinsulin yang diperoleh, dimurnikan dengan kromatografi penukar ion pada penukar anion dan RP (fase terbalik) HPLC (kromatografi cair kinerja tinggi), menunjukkan adanya jembatan disulfida yang sesuai dengan jembatan disulfida dari proinsulin manusia asli. Ini juga melaporkan pengembangan metode baru yang ditingkatkan untuk memperoleh insulin manusia dengan metode rekayasa genetika dalam sel prokariotik. Para penulis menemukan bahwa insulin yang diperoleh dalam struktur dan aktivitas biologisnya identik dengan hormon yang diisolasi dari pankreas [5].

Baru-baru ini, perhatian telah diberikan untuk menyederhanakan prosedur untuk memproduksi insulin rekombinan dengan metode rekayasa genetika. Dengan demikian, protein fusi yang terdiri dari peptida pemimpin interleukin yang melekat pada N-terminal proinsulin diperoleh melalui residu lisin. Protein diekspresikan secara efisien dan terlokalisasi dalam badan inklusi. Setelah isolasi, protein dipecah dengan trypsin untuk menghasilkan insulin dan C-peptida. Kelompok peneliti lain bertindak dengan cara yang sama. Protein fusi yang terdiri dari proinsulin dan dua domain sintetis dari Staphylococcus protein A, yang mengikat IgG, terlokalisasi dalam badan inklusi, tetapi memiliki tingkat ekspresi yang lebih tinggi. Protein diisolasi dengan kromatografi afinitas menggunakan IgG dan diperlakukan dengan trypsin dan carboxypeptidase B. Insulin dan C-peptide yang dihasilkan dimurnikan dengan RP-HPLC. Saat membuat struktur fusi, rasio massa protein pembawa dengan polipeptida target sangat signifikan. Ini adalah bagaimana desain konstruksi fusi dijelaskan, di mana protein yang mengikat albumin serum manusia digunakan sebagai pembawa polipeptida. Satu, tiga, dan tujuh peptida C melekat padanya. C-peptida dikombinasikan atas dasar kepala-ekor menggunakan spacer asam amino yang membawa situs restriksi Sfi I dan dua residu arginin di awal dan di ujung spacer untuk pembelahan protein selanjutnya dengan trypsin. Produk pembelahan HPLC menunjukkan bahwa C-peptida dibelah secara kuantitatif, dan ini memungkinkan menggunakan metode gen sintetis multimerik untuk menghasilkan polipeptida target pada skala industri.

Memperoleh proinsulin mutan, yang berisi penggantian Arg32Tyr. Dengan pembelahan sendi protein ini dengan trypsin dan carboxypeptidase B, insulin asli dan C-peptida yang mengandung residu tirosin terbentuk. Yang terakhir, setelah penandaan 125I, secara aktif digunakan dalam radioimmunoassay [6].

Kontrol Kualitas Insulin

Konten

1. Informasi umum tentang mendapatkan insulin 5

2. Metode yang digunakan untuk mengontrol kualitas insulin 8

Referensi 17

Kutipan dari kantor

1-2% dari populasi Eropa menderita diabetes, dan sekitar 20% dari pasien ini tidak dapat hidup tanpa suntikan insulin. Sejak percobaan pertama tentang penggunaan insulin untuk pengobatan diabetes pada tahun 1922, hormon ini diisolasi dari pankreas hewan (sapi dan babi). Insulin hewan sedikit berbeda dalam urutan asam amino dari insulin manusia.

Insulin manusia dan babi sangat dekat: pada insulin babi, terminal-C threonine dari rantai-B digantikan oleh alanin. Sapi dan insulin manusia berbeda dalam tiga residu asam amino. Perbedaan inilah yang menentukan peningkatan aktivitas imunogenik insulin sapi dibandingkan dengan insulin babi.

Hampir semua pasien yang dirawat dengan insulin sapi memiliki antibodi terhadap insulin dalam darah. Sifat antigenik insulin juga sebagian ditentukan oleh pengotor dalam sediaannya. Kemungkinan besar, itu adalah pembentukan antibodi terhadap insulin yang menjelaskan beberapa efek samping kecil ketika menyuntikkan insulin sapi, misalnya, atrofi lemak subkutan di tempat injeksi ulang. Dalam kasus insulin yang sangat murni, efek ini tidak ada.

Selanjutnya, berkat rekayasa genetika dan menggunakan E. Coli, insulin manusia diperoleh.

Insulin manusia, yang diperoleh oleh E. coli, adalah protein "rekayasa genetika" pertama yang diuji pada manusia. Dalam percobaan dengan sukarelawan sehat, ditemukan bahwa itu aman (tidak menyebabkan alergi dan reaksi yang tidak diinginkan lainnya) dan memiliki kemampuan untuk mengurangi kadar glukosa dalam darah ketika diberikan di bawah kulit atau secara intravena.

Saat ini, insulin manusia semacam itu diperoleh oleh banyak penderita diabetes di seluruh dunia. Ini didahului oleh uji klinis di mana perubahan metabolik dan efek imunologis dipelajari.

Relevansi topik kita adalah bahwa produksi yang tidak terkontrol atau tidak terkontrol dapat menyebabkan pelepasan persiapan insulin yang terkontaminasi, yang pada gilirannya dapat menyebabkan konsekuensi klinis yang merugikan.

Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mempelajari metode yang digunakan dalam pengendalian kualitas insulin.

Referensi

GOST R 52249-2004 "Aturan untuk produksi dan pengawasan mutu obat-obatan" 2004

OFS 42-0002-00 "Botoial endotoxins" 2000

OFS 42-0126-09 "Tes biologis insulin"

Artikel Farmakope Federasi Rusia FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Rekayasa genetika insulin manusia: keberhasilan dan prospek // jurnal kimia Rusia. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - hlm. 34-45.

Goncharenko G.G. Dasar-dasar bioteknologi: Metode pengajaran. kompleks untuk stud.biolog. spesial / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min arr. BPR. - Gomel: EI “GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 hal.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Penerapan metode kinetik-kromogenik untuk penentuan endotoksin bakteri (uji LAL) dalam teknologi pemurnian insulin manusia yang direkayasa genetika // Jurnal biofarmasi - 2009. - Vol. 1. - №1. - hlm. 34-37.