Penentuan glukosa dengan metode glukosa oksidase

Analisis

Menentukan konsentrasi glukosa dalam darah adalah salah satu studi biokimia yang paling sering dilakukan di laboratorium.

Metode glukosa oksidase untuk menentukan glukosa dalam darah dan urin didasarkan pada reaksi oksidasi glukosa di hadapan enzim glukosa oksidase dengan pembentukan hidrogen peroksida, yang pada gilirannya dengan adanya peroksidase mengoksidasi ortotolidin untuk membentuk produk berwarna; o Konsentrasi glukosa dijanjikan oleh jumlah produk berwarna.

Karena metode glukosa oksidase ditujukan untuk mengidentifikasi glukosa, dan tidak semua jenis gula, metode ini digunakan dalam diagnosis banding penyakit berikut:

Prinsip metode glukosa oksidase untuk penentuan glukosa

Glukosa dengan adanya enzim glukosa oksidase dioksidasi oleh oksigen atmosfer untuk membentuk hidrogen peroksida selama reaksi. Hidrogen peroksida dengan adanya enzim peroksidase mengoksidasi orthotoluidine untuk membentuk senyawa berwarna, yang intensitas warnanya sebanding dengan kadar glukosa. Metode ini memungkinkan Anda untuk menentukan tingkat glukosa dalam plasma darah, serum, dan cairan serebrospinal.

Glukosa darah normal, mmol / l

- dalam plasma, dalam natsheartse

bayi baru lahir - 1.7 - 4.2
anak-anak dari 6 minggu hingga 15 tahun - 3.3 - 5.4
dewasa (pria, wanita) - 3,9 - 5,6

- dalam serum, dalam natsheartse

bayi baru lahir - 2.6 - 4.2
anak-anak dari 6 minggu hingga 2 tahun - 3.3 - 5.4
dewasa (pria, wanita) - 3,9 - 5,6

Diperlukan reagen untuk penentuan glukosa dengan metode glukosa oksidase

1. Natrium klorida 9 gram / liter (larutan isotonik): disiapkan dengan melarutkan 0,9 g NaCl dalam 100 ml air.

2. Seng sulfat, 50 g / l: 5 g seng sulfat (ZnSO4) dilarutkan dalam air, volumenya dibawa hingga 100 ml.

3. Natrium hidroksida, 0,3 mol / l: disiapkan dengan melarutkan 1,2 g NaOH dalam 100 ml air, konsentrasinya diperiksa dengan titrasi (seharusnya 0,3 n).

4. Orthotoluidine, larutan 1%: 1 g obat dilarutkan dalam 100 ml alkohol absolut. Solusinya dapat disimpan dalam lemari es di dalam labu dengan penghenti gelas selama beberapa bulan. Produk yang tersedia secara komersial dapat dimurnikan dengan rekristalisasi, untuk itu dilarutkan dalam alkohol absolut, air ditambahkan dan kristal yang diendapkan dihisap pada filter, kemudian dikeringkan dengan kalsium klorida.

5. Larutan buffer asetat pH 4.8: campur 4 bagian asam asetat 0,25 n (periksa dengan titrasi) dan 6 bagian natrium asetat 0,25 n (mengandung 34 g CH3COONa X ЗН2О dalam 1 liter).

6. Glukosa oksidase adalah sediaan kering dengan aktivitas 3000 unit / mg atau lebih.

7. Peroksidase lobak. 1 mg dilarutkan dalam 5 ml buffer asetat, dapat disimpan dalam lemari es selama beberapa hari.

8. Bekerja reagen: melarutkan 2 mg glukosa oksidase dan 1 mg peroksidase dalam 80 ml buffer asetat, tambahkan 1 ml larutan orthotoluidine 1%, campur dan bawa volume hingga 100 ml dengan larutan buffer. Pereaksi yang bekerja harus transparan, tidak berwarna atau memiliki warna hijau pudar, dalam hal ini stabil bila disimpan dalam suhu dingin. Jika warnanya pekat atau setelah beberapa jam setelah persiapan, endapan mulai turun, ini berarti ortotoluidine tidak cukup murni dan perlu direkristalisasi.

9. Solusi glukosa kalibrasi. Glukosa sudah dikeringkan pada suhu 37 ° C dan disimpan dalam desikator. Pertama, siapkan larutan dasar dengan konsentrasi 50 mmol / l, dimana 180 mg zat dilarutkan dalam 20 ml larutan jenuh (sekitar 0,3%) dari asam benzoat. Dari solusi ini, siapkan solusi kalibrasi kerja yang mengandung 3; 6; 9; 12; 15; 18 dan 21 mmol / l, yang mereka ambil 0,6; 1.2; 1.8; 2.4; 3; 3,6 dan 4,2 ml larutan basa dan membawa larutan jenuh asam benzoat ke volume 10 ml. Solusi ini mengandung glukosa dalam konsentrasi yang sama seperti yang terjadi dalam darah, yang memfasilitasi perhitungan selama kalibrasi.

Kemajuan penentuan glukosa dengan metode glukosa oksidase

Dalam tabung centrifuge tambahkan 1,1 ml larutan natrium klorida, 0,4 ml larutan seng sulfat dan 0,4 ml larutan 0,3 n NaOH, campur; pada saat yang sama, gel seng hidroksida yang sangat tipis terbentuk, 0,1 ml darah atau larutan kalibrasi dilepaskan ke dalamnya, dicampur lagi dan disentrifugasi setelah 10 menit pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.

Untuk 1 ml supernatan tambahkan 3 ml reagen yang bekerja dan aduk perlahan.

Warna secara bertahap mulai berkembang, yang pada suhu kamar normal mencapai maksimum dalam 13-15 menit, dan kemudian secara bertahap berkurang. Secara fotometrik selalu setelah periode waktu yang sama setelah menambahkan pereaksi yang bekerja dalam kuvet dengan panjang jalur optik 1 sentimeter dengan filter lampu merah (panjang gelombang 625 nm) terhadap pengalaman idle, yang diatur secara bersamaan dengan sampel yang bekerja, tetapi sebagai ganti darah, gunakan larutan fisiologis natrium klorida.

Saat menyiapkan grafik kalibrasi, 0,1 ml larutan kalibrasi yang tepat diambil alih-alih sampel darah.

Perhitungan glukosa dapat dilakukan sesuai dengan aturan proporsi atau jadwal kalibrasi, untuk membangun dimana konsentrasi glukosa (mmol / l) diletakkan pada satu poros, dan nilai kepunahan ada di yang lain.

Catatan tentang metode penentuan glukosa dengan metode glukosa oksidase

1. Pertama-tama Anda dapat melepaskan darah dari pipet ke dalam larutan isotonik natrium klorida, dan kemudian menambahkan larutan seng sulfat dan NaOH.

2. Dengan kerja sistematis, tidak perlu untuk terus-menerus membangun jadwal kalibrasi untuk semua titik, cukup untuk memproses sampel kosong dan 2-3 poin dalam kisaran 3-9 mmol / l setiap hari, dan membangun jadwal kalibrasi penuh hanya ketika mengganti reagen atau menyesuaikan prosedur.

Metode oksidase glukosa untuk penentuan glukosa

Metode glukosa oksidase digunakan untuk menentukan konsentrasi glukosa secara eksklusif dalam berbagai cairan tubuh. Keuntungan dari tes ini adalah akurasinya. Diagnostik, berbeda dengan metode cepat, memungkinkan untuk mengungkapkan jumlah glukosa murni, tanpa fruktosa dan gula lainnya. Prinsip reaksi ini adalah mewarnai larutan, yang terjadi sebagai akibat interaksi zat pengoksidasi dengan pewarna tertentu. Evaluasi hasil penelitian dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri dan perbandingan dengan solusi standar.

Kapan metode glukosa oksidase diresepkan?

Tes ini digunakan untuk mendeteksi gangguan toleransi gula dan perkembangan pra-diabetes, serta pada puncak penyakit. Tetapi analisis jarang digunakan untuk tujuan seperti itu, ini karena biayanya yang tinggi dan lama menunggu hasilnya. Paling sering, penentuan glukosa dalam darah dan urin menggunakan metode ini digunakan dalam diagnosis banding penyakit seperti:

sindrom intoleransi laktosa;
intoleransi fruktosa;
pelepasan fruktosa dengan cairan tubuh;
peningkatan konsentrasi pentosa dalam urin.

Keuntungan yang tidak diragukan dari tes glukosa oksidase adalah akurasinya.

Apa dasar dari metode ini?

Ada berbagai metode untuk menentukan konsentrasi glukosa dalam darah, tetapi glukosa oksidase adalah yang paling akurat. Intinya adalah bahwa interaksi gula dengan oksigen di udara mengoksidasi reagen. Hidrogen peroksida dilepaskan ke dalam larutan. Zat ini berinteraksi dengan orthotoluidine, membentuk senyawa berwarna. Untuk perilaku reaksi ini membutuhkan adanya enzim khusus. Glukosa oksidase harus ada dalam reaksi oksidasi, dan peroksidase dalam pewarnaan cairan. Intensitas warna larutan akan tergantung pada kadar glukosa dan paling kuat dengan kadar tinggi.

Esensi dari metode glukosa oksidase untuk menentukan glukosa

Evaluasi hasil terjadi menggunakan metode kuantitatif fotometri pada interval waktu yang sama. Pastikan untuk menggunakan solusi kalibrasi yang mengandung kadar gula tertentu dan, mulai dari itu, Anda dapat menilai konsentrasi glukosa dalam cairan tubuh, sering kali dalam darah.

Bagaimana analisis dilakukan?

Bahan diambil dari pasien dengan perut kosong. Untuk tes menggunakan darah vena dalam jumlah 5 ml. Pada malam diagnosis, pasien ditunjukkan diet ketat. Ini akan memungkinkan untuk menilai keandalan hasil dan mengecualikan kemungkinan kesalahan analisis. 2 hari sebelum pengambilan darah, pasien harus menghentikan kebiasaan buruk minum dan merokok. Penting juga untuk membatasi asupan hidangan yang terlalu manis dan, jika mungkin, hindari situasi yang membuat stres.

Paling sering, metode penentuan konsentrasi glukosa ini dilakukan dengan metode sentrifugasi, yang digunakan untuk memisahkan unsur-unsur yang berbentuk. Jumlah gula ditentukan dalam plasma. Ketika semua reagen yang diperlukan ditambahkan ke dalamnya, warna diamati setelah 20 menit jika tes dilakukan pada suhu kamar. Perhitungan kadar glukosa dilakukan sesuai dengan jadwal kalibrasi atau menggunakan aturan porsi.

Reagen untuk penelitian

Untuk menentukan gula yang paling nyaman adalah menggunakan metode cepat untuk penentuan glukosa dalam darah. Ini karena kemudahan penggunaan dan hasil yang cepat. Selain itu, pasien tidak perlu pergi ke laboratorium atau rumah sakit. Tetapi tidak seperti tes glukosa oksidase, diagnosis semacam itu tidak dapat diandalkan. Karena itu tidak membedakan glukosa dari gula lain dan menentukan konsentrasi mereka bersama.

Dasar reaksi glukosa oksidase adalah larutan natrium klorida 9% dan seng sulfat 50%. Mereka ditambahkan pada tahap sentrifugasi darah. Selain itu, gunakan larutan buffer dengan asam asetat dan natrium asetat. Metode titrasi menentukan pH-nya pada 4,8. Setelah itu, ditambahkan glukosa oksidase, yang menyebabkan hidrogen peroksida dan peroksidase, yang terlibat dalam pewarnaan larutan ke konsentrasi yang diinginkan untuk mendapatkan hasil yang akurat.

Standar selama analisis

Jumlah gula diukur dalam satuan khusus - milimol per liter larutan.

Tes darah glukosa oksidase harus dilakukan pada waktu perut kosong dan plasma atau serum digunakan untuk ini. Tingkat angka untuk orang dewasa untuk wanita dan pria adalah 3,3-5,5. Untuk anak-anak di bawah usia 15 tahun, angka ini sedikit lebih rendah dan bervariasi antara 3,2 dan 5,3. Pada bayi baru lahir, glukosa darah adalah 1,7-4,2. Peningkatan kinerja diamati dengan perkembangan pasien dengan diabetes mellitus atau melanggar toleransi glukosa. Kondisi ini adalah pradiabetes, dan jika tidak diobati tepat waktu, maka segera akan menyebabkan perkembangan patologi yang parah ini.

PEKERJAAN nomor 1. PENENTUAN KUANTITATIF GLUKOSA DALAM DARAH. METODE ENZIMATIK (GLUCOSOOXIDAL)

DASAR UNTUK KINERJA PEKERJAAN. Penentuan glukosa dalam darah lengkap atau plasma dilakukan pada setiap pasien untuk menilai keadaan metabolisme karbohidrat dan mendiagnosis patologi (hiperglikemia, hipoglikemia). Metode enzimatik yang didasarkan pada oksidasi glukosa oleh glukosa oksidase menjadi asam glukonat dengan adanya oksigen digunakan untuk menentukan kadar glukosa darah. Metode ini sangat spesifik untuk penentuan D-glukosa dengan adanya zat pereduksi lain yang terkandung dalam ekstrak jaringan dan cairan biologis.

PRINSIP METODE. Glukosa oksidase adalah enzim kompleks yang mengandung FAD sebagai kelompok prostetik. Ketika glukosa dioksidasi oleh glukosa oksidase, dua atom hidrogen terpisah dari atom karbon pertama dalam molekul glukosa. Selanjutnya, kedua atom hidrogen ini ditransfer ke FAD, FADH terbentuk₂. Yang terakhir mentransfer atom hidrogen ke oksigen molekuler untuk membentuk H₂Oh₂. Lalu H₂Oh₂ itu dibelah oleh enzim peroksidase menjadi air dan oksigen atom, yang mengoksidasi kromogen (pewarna), yang menjadi berwarna selama oksidasi.

Metode glukosa oksidase

Saat ini, metode berdasarkan penggunaan enzim glukosa oksidase paling banyak digunakan. Metode ini didasarkan pada reaksi berikut:

Glukosa oksidase mengkatalisis transfer dua atom hidrogen dari atom karbon pertama glukosa ke oksigen yang dilarutkan dalam pereaksi cair. Dalam proses reaksi, hidrogen peroksida dibentuk dalam jumlah yang sama. Yaitu konsentrasi hidrogen peroksida yang terbentuk persis sama dengan konsentrasi glukosa yang ditentukan. Akibatnya, penggunaan reaksi glukosa oksidase mengubah masalah penentuan konsentrasi glukosa menjadi masalah menentukan konsentrasi hidrogen peroksida, yang, seperti yang akan ditunjukkan di bawah ini, jauh lebih sederhana daripada yang pertama. Dan di sini ada beberapa metode yang banyak digunakan saat ini dalam praktik laboratorium (lihat diagram).

Di antara metode pendaftaran di atas, metode biokimia fotometrik yang paling banyak digunakan, di mana molekul hidrogen peroksida di bawah aksi enzim peroksidase terpecah menjadi pembentukan bentuk oksigen aktif - radikal anion superoksida - O₂ -, yang pada gilirannya mengoksidasi kromogen, yang mengarah ke perubahan signifikan dalam spektrum penyerapan kromogen.

Popularitas tinggi metode ini untuk menentukan glukosa adalah karena spesifisitasnya yang tinggi dan kemudahan implementasi. Metode ini dapat diimplementasikan menggunakan fotometer konvensional, serta menggunakan autoanalyzers biokimia otomatis.

Metode glukosa oksidase diakui saat ini sebagai salah satu metode kuantitatif yang paling akurat untuk penentuan glukosa. Sebagai bahan biologis digunakan sebagai serum, dan darah lengkap. Ketika bekerja dengan yang terakhir harus mempertimbangkan fakta bahwa ketika darah kapiler diambil, proporsi serum (plasma) tergantung pada nilai hematokrit, yang dapat mempengaruhi keakuratan hasil. Karena itu, ketika menentukan glukosa dengan metode yang dijelaskan di atas, lebih disukai menggunakan serum pasien.

Seiring dengan metode fotometrik titik akhir, beberapa tahun yang lalu, kit muncul di mana metode fotometrik kinetik diimplementasikan. Inti dari metode ini adalah bahwa pada rasio tertentu dari aktivitas glukosa oksidase dan peroksidase, laju pembentukan senyawa berwarna untuk beberapa waktu setelah menambahkan sampel ke larutan kerja akan sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam sampel. Keuntungan dari metode ini adalah bahwa hasilnya tidak tergantung pada keberadaan senyawa lain dalam sampel, karena penyerapan yang terakhir stabil dari waktu ke waktu. Metode ini membutuhkan penggunaan fotometer kinetik, analisis semi-otomatis, atau analisis biokimia otomatis. Pengukuran konsentrasi glukosa dari seluruh darah dilakukan dengan mudah menggunakan instrumen yang operasinya didasarkan pada prinsip pengukuran amperometrik, menggunakan sensor enzim khusus. Hidrogen peroksida adalah senyawa kimia yang sangat tidak stabil, dan dapat berfungsi sebagai sumber partikel bermuatan. Inilah yang digunakan dalam sensor enzim dari tipe membran atau dalam elemen elektrokimia dari glukometer portabel.

Sebagai kesimpulan, kita harus menyebutkan kelemahan metode glukosa oksidase. Radikal hidrogen peroksida dan anion superoksida yang dihasilkan tidak hanya dapat mengoksidasi kromogen, tetapi juga zat lain yang ada dalam cairan biologis: asam askorbat, asam urat, bilirubin. Pada saat yang sama, masing-masing, proporsi peroksida, yang mengambil bagian dalam oksidasi kromogen, menurun, yang mengarah pada perkiraan glukosa yang terlalu rendah. Metode ini adalah linier, sebagai aturan, hingga 20-30 mmol / l glukosa.

Penentuan kuantitatif glukosa darah dengan metode glukosa oksidase

Prinsip metode. Metode ini didasarkan pada kekhususan aksi enzim glukosa oksidase. Enzim ini mengoksidasi glukosa dengan adanya oksigen molekuler untuk membentuk glukololakton, yang secara spontan menghidrolisis menjadi asam glukonat. Glukosa oksidase mengoksidasi glukosa untuk membentuk hidrogen peroksida (H₂Oh₂), yang di bawah aksi peroksidase bereaksi dengan 4-aminoantipyrin dan fenol. Hasilnya adalah senyawa berwarna merah muda, kepadatan optik yang pada 510 nm sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam sampel.

2 N₂Oh₂ + 4-aminoantipyrin + fenol → quinone imine + 4H₂Oh

Peralatan: KFK, centrifuge, termostat, tripod, tabung reaksi, pipet, bahan biologis, reagen yang terkandung dalam solusi kerja.

sampel uji, ml

sampel standar, ml

tes tunggal (N₂O), ml

Solusi glukosa kalibrasi (standar)

Tabung diinkubasi dalam termostat pada suhu 37 ° C selama 15 menit, kemudian diwarnai dengan filter hijau dalam filter hijau dalam cuvette dengan ketebalan lapisan 5 mm terhadap blanko (H₂O). Warna pink stabil selama 1 jam setelah inkubasi.

Perhitungan kadar glukosa yang dihasilkan oleh formula:

C = x standar C, di mana

C adalah kadar glukosa dalam sampel percobaan, mol / l;

Eop adalah densitas optik sampel;

Est adalah densitas optik dari sampel kalibrasi;

С standar - konten dalam larutan kalibrasi, mol / l.

Nilai normal:  bayi baru lahir - 2.8-4.4 mmol / l

 anak-anak - 3,9 -5,8 mmol / l

 dewasa - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hipoglikemia (HGH). Peningkatan glukosa darah disebabkan oleh banyak alasan, yang menurutnya ada dua kelompok hiperglikemia.

1. Insular - terkait dengan konten yang tidak mencukupi dalam tubuh insulin atau karena ketidakefektifan aksinya.

2. Extrainsular (ekstrainsular) - tidak tergantung pada efek insulin.

Proses-proses berikut ini paling penting dalam pembentukan HGH: peningkatan pemecahan glikogen; peningkatan neoglucogenesis; penghambatan sintesis glikogen; penurunan pemanfaatan glukosa oleh jaringan di bawah pengaruh hormonal antagonis insulin: somatotropin, glukortikoid, tiroksin, tirotropin.

Hiperglikemia alimenter dicatat dengan suplai glukosa yang berlebihan dalam darah (misalnya, hiperglikemia di bawah beban gula). Hiperglikemia "hati" terjadi pada lesi difus hati.

Hiperglikemia persisten dan berat paling sering menyertai diabetes mellitus. Merupakan kebiasaan untuk mengisolasi diabetes mellitus yang tergantung insulin dan diabetes mellitus yang tidak tergantung insulin, atau, masing-masing, diabetes mellitus tipe I dan diabetes mellitus tipe II. Pembentukan diabetes mellitus tipe I dikaitkan terutama dengan gangguan sintesis dan pertukaran insulin.

Kelompok kedua hiperglikemia dikaitkan terutama dengan hiperfungsi kelenjar endokrin yang menghasilkan hormon - antagonis insulin. Itu diamati pada penyakit seperti sindrom dan penyakit Cushing, akromegali, tirotoksikosis, pheochromocytoma, glukogenoma. Kadar glukosa darah juga meningkat pada penyakit hati tertentu (khususnya, pada 10-30% pasien dengan sirosis hati), hemochromatosis (sirosis pigmen hati, diabetes perunggu).

Hipoglikemia (HGP) - penurunan glukosa darah - paling sering dikaitkan dengan peningkatan absolut atau relatif kadar insulin dalam darah. Vnepankreaticheskim hipoglikemia diamati sebagai akibat dari ketidakseimbangan antara sejauh proses glikogenolisis dan glukoneogenesis di hati selama penyakit hati hepatitis akut dan kronis, sirosis, akut dan subakut, keracunan alkohol, keracunan arsenik, fosfor, selama penyakit kuning berkepanjangan mekanik, hati kongestif, primer atau kanker hati metastatik. Penurunan konsentrasi glukosa darah sering diamati pada pasien yang menderita kanker kerongkongan dan tumor ganas lainnya dari pelokalan ekstrapancreatic (fibroma, fibrosarcoma, neuroma), serta muntah yang tidak dapat dicegah, anoreksia, diabetes hati, uremia, laktasi berlimpah dan glukosuria pada wanita hamil.

Hipoglikemia dapat berasal dari pusat karena trauma mental, ensefalitis, perdarahan subaraknoid, tumor otak.

1. Gangguan herediter pencernaan karbohidrat.

2. Jenis-jenis hyperglucose apa yang Anda ketahui?

3. Apa penyebab hiperglukosemia patologis?

4. Apa penyebab diabetes mellitus tergantung insulin?

5. Apa penyebab biokimia dari penyakit keturunan: a) glikogenosis? b) aglikogenosis? c) fruktosemia? d) galaktosemia?

6. Apa saja perubahan biokimia dalam metabolisme karbohidrat selama puasa?

7. Prinsip metode penentuan toleransi glukosa.

Glukosa oksidase dan metode heksokinase untuk penentuan glukosa serum dalam darah

Diagnosis yang akurat, perawatan resep memerlukan serangkaian tes laboratorium.

Metode penentuan glukosa serum adalah alat yang paling penting untuk mendeteksi hiper dan hipoglikemia pada pasien dengan diabetes mellitus.

Metode ini memungkinkan untuk menyesuaikan gangguan metabolisme data terapi medis. Level glukosa diagnostik juga dapat ditentukan dalam darah lengkap dan plasma.

Metode untuk penentuan glukosa darah

Metode untuk menentukan jumlah glukosa dalam darah banyak dikembangkan.

Beberapa dari mereka (redukometrik, kolorimetri) praktis tidak digunakan karena toksisitas yang tinggi dan akurasi hasil yang rendah.

Studi enzim yang paling umum digunakan. Metode glukosa oksidase adalah metode reaksi warna yang terjadi ketika karbohidrat dipanaskan. Hexokinase menentukan aktivitas darah pada hexokinase.

Metode glukosa oksidase

Metode glukosa oksidase untuk menentukan glukosa darah didasarkan pada reaksi oksidasi di bawah pengaruh suatu enzim. Ini membentuk hidrogen peroksida, menodai zat Chromogen, konsentrasi yang menentukan jumlah glukosa.

Metode glukosa oksidase digunakan untuk:

intoleransi fruktosa herediter;
pentozurii;
intoleransi laktulosa.

Kerugian dari penelitian ini adalah bahwa hidrogen peroksida mampu mengoksidasi baik kromogen maupun askorbat, asam urat, dan bilirubin yang ada dalam darah. Hitung jumlah metode fotometrik glukosa, intensitas pewarnaan dibandingkan dengan grafik kalibrasi.

Dalam kondisi laboratorium, tingkat suatu zat dapat ditentukan:

dalam darah vena. Analisis otomatis digunakan;
dalam darah kapiler. Pagar dilakukan dari jari.

Metode elektrokimia terdiri dari penggunaan elektroda yang mengandung glukosa oksidase. Jumlah hidrogen peroksida yang dihasilkan, atau tingkat oksigen yang tersisa yang dikonsumsi selama proses oksidasi, ditentukan.

Metode heksokinase

Zat ini adalah enzim metabolisme glukosa yang paling penting, yang membatasi kecepatan proses dalam sel.

Dalam kondisi laboratorium, di bawah aksi hexokinase, glukosa difosforilasi oleh adenosin trifosfat.

Sebagai hasil dari reaksi, molekul organik terbentuk, yang jumlahnya ditentukan oleh tingkat penyerapan cahaya di zona ultraviolet. Reaksi hexokinase positif yang terlalu cepat juga bisa menjadi pertanda terjadinya tumor ganas.

Persiapan untuk analisis

Tes glukosa serum darah ditentukan untuk:

Sebelum analisis, Anda harus mengikuti sejumlah kondisi agar hasilnya seandal mungkin:

Penelitian dilakukan dengan perut kosong. Bahan diambil di pagi hari;
beberapa hari sebelum diagnosis, perlu untuk menghindari aktivitas fisik yang berat, stres;
Dalam diet harian pasien harus mengonsumsi setidaknya 150 gram karbohidrat. Dengan kekurangan, tingkat glukosa akan meningkat, dan turun perlahan, yang mengubah analisis data;
sehari sebelum diagnosa tidak bisa merokok dan minum minuman beralkohol;
tidak mungkin untuk melakukan penelitian setelah operasi berat, melahirkan, di hadapan radang. Kontraindikasi dalam analisis sirosis hati, eksaserbasi penyakit lambung, proses tumor;
beberapa hari sebelum penelitian, seseorang tidak boleh menjalani prosedur fisioterapi, minum kontrasepsi oral, obat diuretik, obat psikotropika, kafein.

Analisis ini dapat memberikan hasil positif palsu pada hipokalemia dan penyakit endokrin (sindrom Cushing, tirotoksikosis).

Norma glukosa dalam serum darah berdasarkan usia

Indikator normal tergantung pada usia:

darah tali pusar mungkin mengandung 2,5-3,3 mmol / l;
pada bayi prematur - dari 1,1 hingga 3 mmol / l;
anak-anak pada hari pertama kehidupan - dari 2,22 hingga 3,33;
pada usia 2,7 hingga 4,4;
pada anak di atas 6 tahun - dari 3,3 hingga 5,5 mmol / l;
pada orang dewasa hingga 60 tahun - dari 4,4 hingga 6,3;
pada orang tua - dari 4,6 hingga 6,1 mmol / l.

Hipoglikemia pada orang dewasa didiagnosis dengan nilai glukosa kurang dari 3,3 mmol / l, dan hiperglikemia - lebih dari 6,1 mmol / l.

Metode oksidase glukosa untuk penentuan glukosa dalam plasma

Kami senang menyambut Anda di situs www.unimedao.ru!

Terima kasih telah menjawab pertanyaan kami.

11/19/2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Dari arsip surat kabar "News A / O Unimed"

Penentuan konsentrasi glukosa dalam darah adalah salah satu studi biokimia yang paling sering dilakukan di QDL. Alasan popularitas yang luar biasa dari tes ini terkait dengan tingginya insiden diabetes. Tes ini dilakukan di klinik rawat inap dan rawat jalan. Pasien dengan diabetes terpaksa memeriksa kadar glukosa dalam darah di rumah, karena tanpa informasi ini sulit bagi mereka untuk menyesuaikan diet, olahraga, penggunaan insulin dan obat antidiabetik lainnya. Pentingnya pengujian dan volume besar penelitian yang dilakukan telah merangsang pengembang untuk menciptakan berbagai jenis perangkat dan metode untuk menentukan konsentrasi glukosa dalam darah.

Saat ini, ada banyak metode untuk menentukan glukosa. Mereka dapat diklasifikasikan sebagai berikut.

Metode untuk penentuan glukosa dalam serum

- fotometri titik akhir

- fotometri reflektif - kimia kering

Dua metode pertama sangat tidak nyaman, beracun dan memiliki akurasi rendah, jadi kami tidak akan membahasnya.

Metode glukosa oksidase

Saat ini, metode berdasarkan penggunaan enzim glukosa oksidase paling banyak digunakan. Metode ini didasarkan pada reaksi berikut:

Dalam gbr. Gambar 1 dan 2 menunjukkan spektrum solusi kerja sebelum dan sesudah menambahkan larutan glukosa standar. Penyerapan maksimum campuran reaksi - (reagen + glukosa) adalah di wilayah 500 nm. Dengan demikian, perubahan densitas optik dari reaksi akhir pada panjang gelombang 480-520 nm sebanding dengan konsentrasi glukosa yang terkandung dalam sampel.

Popularitas tinggi metode ini untuk menentukan glukosa adalah karena spesifisitasnya yang tinggi dan kemudahan implementasi. Metode ini dapat diimplementasikan menggunakan fotometer konvensional (lebih baik daripada fotometer biokimia khusus seperti Mikrolab 540), atau dengan bantuan autoanalyzers biokimia otomatis.

Seiring dengan metode fotometrik titik akhir, beberapa tahun yang lalu, kit muncul di mana metode fotometrik kinetik diimplementasikan. Inti dari metode ini adalah bahwa pada rasio tertentu dari aktivitas glukosa oksidase dan peroksidase, laju pembentukan senyawa berwarna untuk beberapa waktu setelah menambahkan sampel ke larutan kerja akan sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam sampel. Keuntungan dari metode ini adalah bahwa hasilnya tidak tergantung pada keberadaan senyawa lain dalam sampel, karena penyerapan yang terakhir stabil dari waktu ke waktu. Metode ini memerlukan penggunaan fotometer kinetik, misalnya Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, penganalisis semi-otomatis, seperti Clima 15, atau penganalisa biokimia otomatis. Pengukuran konsentrasi glukosa dari seluruh darah dilakukan dengan mudah menggunakan instrumen yang operasinya didasarkan pada prinsip pengukuran amperometrik, menggunakan sensor enzim khusus. Hidrogen peroksida adalah senyawa kimia yang sangat tidak stabil dan dapat berfungsi sebagai sumber partikel bermuatan. Inilah yang digunakan dalam sensor enzim dari tipe membran atau dalam elemen elektrokimia dari glukometer portabel.

Sampel darah lengkap (biasanya 20 μl) diencerkan dalam larutan buffer sistem (sel darah merah dihancurkan), dan kemudian dimasukkan melalui garis ke dalam sel aliran. Glukosa, mengalami oksidasi di bawah pengaruh enzim glukosa oksidase, yang terletak di membran. Hidrogen peroksida yang dihasilkan berdifusi melalui membran dan selanjutnya teroksidasi dalam reaksi katalitik di bawah aksi platinum. Difusi hidrogen peroksida pada permukaan platinum membentuk arus yang sebanding dengan jumlah molekul H₂Oh₂. Sinyal yang diperoleh diproses oleh perangkat pada nilai tegangan yang sesuai. Nilai yang diukur ini sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam sampel.

Sebagai contoh instrumen yang menggunakan metode yang dijelaskan di atas, kita dapat menyebutkan penganalisa glukosa Biosen (Jerman). Perangkat ini nyaman digunakan tidak hanya di rumah sakit, tetapi juga di poliklinik, di mana pengujian glukosa dilakukan terutama dari darah kapiler.

Langkah penting dalam pengembangan metode diagnostik laboratorium klinis adalah munculnya "kimia kering". Secara alami, salah satu aplikasi pertama dari teknologi ini adalah tugas untuk menentukan glukosa dalam darah pasien. Perangkat pertama secara signifikan lebih rendah dalam akurasi dengan metode penelitian laboratorium tradisional. Namun, seiring waktu, sejumlah perusahaan berhasil mengembangkan strip diagnostik dan fotometer reflektif, yang memberikan akurasi analisis yang sangat tinggi. Glukometer One Touch dan Life Scan (USA) sangat populer di seluruh dunia dan berhasil menggabungkan akurasi analitik metode enzimatik kuantitatif dengan kecepatan dan kesederhanaan "kimia kering".

Pengukur glukosa darah One Touch dirancang untuk mengukur kadar glukosa dalam darah lengkap secara cepat dan akurat. Strip uji One Touch berisi semua komponen kimia yang diperlukan untuk metode dua langkah glukosa oksidase, termasuk enzim glukosa oksidase dan peroksidase, yang diserap ke dalam membran hidrofilik berpori yang unik. Hasil dari reaksi adalah pembentukan kompleks berwarna. Intensitas warna yang dikembangkan direkam dengan miniphotometer reflektif.

Strip uji membran One Touch menyerupai spons dengan pori-pori mikroskopis dan melakukan fungsi rangkap tiga. Kerjanya: 1) sebagai reservoir, mengumpulkan jumlah darah yang diperlukan, 2) sebagai filter, menghalangi bahan seluler padat (eritrosit, leukosit, dll.), 3) sebagai permukaan optik halus tempat cahaya yang dipantulkan diukur. Fungsi terakhir, khususnya, sangat penting untuk pengoperasian perangkat. Memungkinkan untuk membaca bagian bawah strip, sementara darah tetap berada di bagian atas strip tes. Karenanya, tidak perlu untuk mencuci (membersihkan) darah dari permukaan strip tes.

Selain itu, membran memiliki sifat hidrofilik, yang menyebabkan setetes darah “menarik” ke permukaan strip uji ketika disentuh.

Perangkat One Touch mencakup dua LED khusus. Memproses warna yang dikembangkan pada strip tes adalah sebagai berikut. Segera setelah strip uji dimasukkan ke dalam perangkat, pembacaan nol terjadi. Pada saat ini di layar kita melihat: "TUNGGU". Ketika setetes darah diterapkan pada strip tes, plasma darah langsung diserap oleh membran, sementara eritrosit dan kelebihan plasma tetap di permukaan membran. Setelah penyerapan penuh setetes darah, pewarnaan segera terjadi. Perangkat merekam perubahan dalam besarnya refleksi dan secara otomatis memulai timer. Setelah 45 detik, reaksi kimia berakhir, hasil pantulan cahaya diproses. Produk reaksi berwarna menyerap cahaya yang dipancarkan oleh LED pertama. Sel darah dan kelebihan plasma juga menyerap cahaya yang dipancarkan oleh dioda. Untuk memperbaiki refleksi latar belakang, pembacaan kedua dilakukan oleh LED kedua pada panjang gelombang yang berbeda. Perbedaan antara sinyal dari LED pertama dan kedua membawa informasi tentang penyerapan cahaya oleh kromogen. Sinyal yang diterima dari kromogen untuk memperkirakan konsentrasi glukosa berkorelasi dengan kalibrasi khusus. Semua perangkat One Touch dikalibrasi menggunakan metode referensi pada penganalisa glukosa laboratorium. Dengan prosedur ini, kurva kalibrasi standar diperoleh. Perlu dicatat bahwa agak sulit untuk menetapkan produksi strip uji, yang secara kimiawi akan sama, karena konsentrasi reagen yang sangat rendah. Untuk mengatasi masalah ini, kurva kalibrasi standar digunakan, yang terdiri dari 16 garis kalibrasi. Kontrol kualitas dilakukan segera setelah produksi strip uji, yang memungkinkan untuk menentukan jalur kalibrasi mana (dari 1 hingga 16) yang dapat diterapkan ke strip uji ini. Ini adalah nomor kode yang disebut, yang ditempelkan pada kemasan strip tes. 16 garis kalibrasi ini juga diprogram dalam mikroprosesor instrumen. Untuk mendapatkan hasil yang akurat secara optimal, nomor kode yang tertera pada kemasan strip tes diatur dalam perangkat menggunakan tombol kode. Dengan demikian, kode yang tidak dipasang dengan benar pada instrumen dapat menyebabkan kesalahan pengukuran.

Sejak munculnya perangkat One Touch di pasaran, sejumlah besar studi klinis telah berlalu di laboratorium di Rusia, Amerika, dan Eropa. Salah satu penelitian tersebut dilakukan oleh Pusat Ilmiah Endokrinologis dari Akademi Ilmu Kedokteran Rusia atas permintaan Asosiasi Diagnostik Laboratorium Medis Rusia. Spesialis pusat melakukan analisis komparatif dari dua metode untuk mengukur kadar glukosa darah. Hasil yang diperoleh pada One Touch dibandingkan dengan data yang diperoleh pada penganalisa biokimia Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), yang mengimplementasikan metode hexokinase untuk penentuan glukosa. 190 sampel darah dari 95 pasien diperiksa. Koefisien korelasi hasil adalah 0,98641. Koefisien variasi dalam rentang normal dan patologis pada One Touch meter tidak melebihi 2,5%.

Laporan resmi Pusat Penelitian Endokrinologis dari Akademi Ilmu Kedokteran Rusia mengatakan: "Perangkat One Touch memiliki akurasi dan akurasi yang tinggi, serta berbagai pengukuran. Mereka dapat digunakan untuk mendiagnosis kondisi darurat pada diabetes, termasuk tim darurat, karena perangkat ini tidak hanya dapat diandalkan, tetapi mereka juga dengan cepat menghasilkan hasil. "

Metode heksokinase

Pendaftaran dilakukan pada panjang gelombang 340 nm pada penyerapan NADH. Metode ini sangat spesifik dan tidak bereaksi dengan komponen serum darah lainnya. Metode hexokinase dianggap sebagai referensi untuk penentuan glukosa. Sebagai aturan, itu linier hingga 50 mmol / l, yang memungkinkannya direkomendasikan secara luas untuk klinik dengan departemen endokrinologis.

Dari berbagai metode yang dijelaskan untuk penentuan glukosa, karyawan QDL dapat memutuskan sendiri metode penentuan dan perangkat yang dipilih:

Metode biokimia "basah", yang diimplementasikan pada alat analisis biokimia otomatis, akan menyediakan kebutuhan laboratorium dengan aliran analisis yang besar.
Alat analisis glukosa tipe bias membutuhkan usaha minimal dari operator, karena sepenuhnya otomatis dan cukup produktif (kecepatan 50 hingga 200 sampel per jam).
Untuk laboratorium dengan sejumlah kecil studi, serta laboratorium ekspres, fotometer biokimia khusus Mikrolab 540 mudah digunakan.
Untuk tim bantuan, sembunyikan bantuan adalah solusi sempurna - meteran glukosa darah seperti One Touch.

Dengan demikian, tugas QDL untuk memastikan tidak hanya cepat, tetapi juga penentuan glukosa yang sangat akurat, sepenuhnya dapat dipecahkan saat ini.

Glukosa darah, urin, minuman keras

Glukosa darah dikontrol dengan ketat.

Kontrol konsentrasi glukosa dalam darah dilakukan oleh pengaruh saraf dan hormon.

Regulasi saraf

Regulasi saraf konsentrasi glukosa dalam darah dinyatakan dalam efek positif n.vagus pada sekresi insulin dan efek penghambatan pada proses persarafan simpatis ini. Selain itu, pelepasan adrenalin ke dalam darah tunduk pada pengaruh simpatik.

Regulasi hormonal

Faktor regulasi hormon utama adalah glukagon, adrenalin, glukokortikoid, hormon somatotropik di satu sisi, dan insulin di sisi lain. Semua hormon, kecuali insulin, yang mempengaruhi hati, meningkatkan glikemia.

Insulin adalah satu-satunya hormon dalam tubuh yang ditujukan untuk menurunkan kadar glukosa darah. Dengan pengaruhnya, glukosa sangat diserap oleh otot dan jaringan adiposa.

Penurunan konsentrasi glukosa darah oleh insulin dicapai dengan cara-cara berikut:

transisi glukosa ke dalam sel - aktivasi protein transporter GluT 4 pada membran sitoplasma,
keterlibatan glukosa dalam glikolisis - peningkatan sintesis glukokinase, enzim yang disebut perangkap glukosa, stimulasi sintesis enzim glikolisis utama lainnya - fosfofruktokranase, piruvat kinase,
peningkatan sintesis glikogen - aktivasi glikogen sintase dan stimulasi sintesisnya, yang memfasilitasi konversi kelebihan glukosa menjadi glikogen,
aktivasi jalur pentosa fosfat - induksi sintesis dehidrogenase glukosa-6-fosfat dan dehidrogenase 6-fosfoglukonat,
peningkatan lipogenesis - keterlibatan glukosa dalam sintesis triasilgliserol atau fosfolipid.

Banyak jaringan yang sama sekali tidak sensitif terhadap aksi insulin, mereka disebut insulin-independent. Ini termasuk jaringan saraf, tubuh vitreous, lensa, retina, sel ginjal glomerular, sel endotel, testis, dan sel darah merah.

Glukagon meningkatkan glukosa darah:

meningkatkan mobilisasi glikogen melalui aktivasi glikogen fosforilase,
merangsang glukoneogenesis - meningkatkan kerja enzim piruvat karboksilase, fosfoenolpiruvat karboksinase, fruktosa-1,6-difosfatase.

Adrenalin menyebabkan hiperglikemia:

mengaktifkan mobilisasi glikogen - stimulasi glikogen fosforilase,

Glukokortikoid meningkatkan glukosa darah

dengan menekan transisi glukosa ke dalam sel,
merangsang glukoneogenesis - meningkatkan sintesis enzim piruvat karboksilase, fosfoenolpiruvat karboksibase, fruktosa-1,6-difosfatase.

Tabel tersebut merangkum aspek utama dari pengaruh hormon:

Aktivasi glikogenolisis di hati;
Stimulasi glukoneogenesis;

Peningkatan glukoneogenesis;
Penurunan permeabilitas membran terhadap glukosa.

Glukosa darah dalam praktik klinis

Lebih dari 90% dari semua karbohidrat darah rendah molekul rendah adalah glukosa; selain itu, fruktosa, maltosa, manosa dan pentosa dapat hadir dalam jumlah kecil, dan dalam kasus patologi, galaktosa. Bersamaan dengan mereka dalam darah mengandung polisakarida yang terkait dengan protein.

Terutama glukosa intensif dikonsumsi dan digunakan untuk berbagai kebutuhan jaringan sistem saraf pusat, sel darah merah, medula ginjal. Dalam metabolisme antara, glukosa digunakan untuk membentuk glikogen, gliserol dan asam lemak, asam amino, asam glukuronat dan glikoprotein. Konsentrasi glukosa dalam darah merupakan turunan dari glikolisis dan oksidasi asam trikarboksilat dalam siklus TCA, glikogenesis dan glikogenolisis dalam hati dan jaringan otot, glukoneogenesis di hati dan ginjal, dan asupan glukosa dari usus.

Dalam praktik klinis, kadar glukosa darah biasanya diperiksa, konsentrasi gula lain dan glikogen lebih jarang digunakan. Dalam darah manusia, glukosa terdistribusi secara merata antara plasma dan unsur-unsur yang terbentuk, telah ditetapkan bahwa kadar gula dalam darah vena adalah 0,25-1,0 mmol / l (rata-rata 10%) kurang dari pada darah arteri dan kapiler. Definisi asam laktat dan piruvat, aktivitas sejumlah enzim metabolisme karbohidrat, asam sialic dan hexuronic, seromucoids, hemoglobin terglikosilasi, dan indikator lainnya memiliki nilai diagnostik yang diketahui.

Kandungan glukosa dalam urin tergantung pada konsentrasinya dalam darah, meskipun diekskresikan dalam kadar gula darah normal dan tinggi. Dengan peningkatan konsentrasi glukosa dalam darah, yang disebut ambang ginjal diatasi (pada orang sehat itu terletak di wilayah 8,3-9,9 mmol / l) dan terjadi glukosuria. Dengan ginjal arteriosklerotik, dengan diabetes, ambang meningkat dan glukosuria mungkin tidak dicatat bahkan dengan peningkatan konsentrasi glukosa menjadi 11,0-12,1 mmol / l.

Metode untuk penentuan glukosa darah

Metode untuk penentuan glukosa darah dibagi menjadi tiga kelompok: reduksi, kolorimetri, dan enzimatik.

Metode reduksi (Harus diingat bahwa metode kelompok ini memberikan hasil perkiraan berlebihan (sekitar 20-25%), karena darah mengandung sejumlah senyawa yang tidak berhubungan dengan karbohidrat, tetapi memiliki sifat pereduksi (asam urat, glutathione, kreatinin, askorbat). asam)):
- Metode titrometri Hagedorn-Jensen didasarkan pada sifat gula untuk dipulihkan, ketika mendidih dalam medium alkali, garam-garam besi dan garam-lumpur kalium besi. Menurut tingkat pemulihan ini, konsentrasi gula dalam darah diselidiki oleh titrometri. Keuntungan penting dari metode ini adalah biaya yang rendah dan kemungkinan penggunaan di laboratorium apa pun;
- berdasarkan pada reduksi nitrobenzen, misalnya asam pikrat menjadi asam pikramat;
- metode berdasarkan kemampuan glukosa untuk mengurangi garam tembaga. Tembaga monovalen yang dihasilkan bertindak sebagai zat antara. Teroksidasi oleh oksigen udara, ia mengembalikan asam arsenik-molibdat atau asam fosforotungstik, yang berfungsi sebagai kromogen akhir.
Metode kolorimetri. Ini termasuk:
- Metode Somodzhi - reaksi reduksi tembaga, yang berada dalam komposisi reagen tembaga-ortron, menjadi tembaga oksida. Metode ini sulit, multi-bertahap, tidak spesifik dan praktis tidak digunakan saat ini;
- Metode Folin-Wu - reduksi tartrat tembaga menjadi lithium oksida. Metodenya sederhana, kerugiannya adalah kurangnya proporsionalitas yang ketat antara intensitas warna yang diperoleh dan konsentrasi glukosa;
- penentuan konsentrasi glukosa menurut Morris dan Roe - dehidrasi glukosa di bawah aksi asam sulfat dan transformasinya menjadi oxymethylfurfural, yang mengembun dengan arthron menjadi senyawa biru. Membutuhkan pereaksi paling murni dan kepatuhan yang ketat terhadap suhu reaksi konstan;
- Metode ortotoluidin Gultman dalam modifikasi Khivarinen-Nikkil, yang terdiri dalam menentukan intensitas pewarnaan larutan yang terjadi ketika ile amino orthotoluidine aromatik berinteraksi dengan kelompok aldehida glukosa dalam medium asam. Metode ini akurat dan memungkinkan penentuan glukosa yang lebih spesifik.
- Metode anilin, mempertahankan sensitivitas metode orthotoluidine, tetapi bahkan lebih spesifik.
Metode enzimatik:
- berdasarkan pada reaksi hexokinase. Glukosa di bawah aksi heksokinase difosforilasi oleh ATP, Gl - 6 - F yang dihasilkan dengan adanya dehidrogenase mengembalikan NADP. Jumlah yang terakhir ditentukan oleh peningkatan penyerapan cahaya di wilayah ultraviolet. Metode ini terlalu mahal untuk laboratorium praktis.
- berdasarkan pada oksidasi glukosa menjadi asam glukuronat menggunakan enzim glukosa oksidase dan pembentukan selama reaksi hidrogen peroksida, yang (dalam versi yang berbeda):
  - ditentukan dengan cara kimia;
  - dengan partisipasi peroksidase, ia mengoksidasi ortotolidin yang tidak berwarna, mengubahnya menjadi senyawa berwarna hijau-biru, kelurusan ketergantungan warna pada konsentrasi glukosa tetap berkisar antara 1,1 hingga 22 mmol / l;
  - di hadapan fenol dengan partisipasi peroksidase, mengoksidasi 4 - aminoantipirina menjadi senyawa berwarna merah tua;
  - di hadapan ion tembaga, itu mengoksidasi fenolftalin menjadi fenolftalein, yang diwarnai merah di bawah kondisi alkali.
Metode elektrokimia yang menggunakan elektroda yang mengandung enzim amobil, khususnya, glukosa oksidase. Reaksi dicatat dengan jumlah hidrogen peroksida yang terbentuk atau oleh hilangnya oksigen yang dikonsumsi untuk oksidasi glukosa.
Strip diagnostik menggunakan reaksi glukosa oksidase-peroksidase dan turunan benzidin sebagai kromogen.

Tiga metode diadopsi sebagai satu kesatuan: metode titrometri Haggedorn-Jensen, metode orto-toluidin dan metode glukosa oksidase o-tolidin.

Penentuan glukosa dengan metode orthotoluidine

Prinsip

Glukosa ketika dipanaskan dengan orthotolude dengan adanya asam sulfat memberikan warna biru-hijau.